低含量含砷水暴露對(duì)子代鼠生長(zhǎng)和發(fā)育的影響*

萬(wàn)君，柯紅，王磊，洪小平，吳莉，崔潔

[1.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（葛洲壩集團(tuán)中心醫(yī)院） 藥學(xué)部，湖北 宜昌 443002；2. 三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（葛洲壩集團(tuán)中心醫(yī)院） 腫瘤科，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)部，湖北 宜昌 443002]

流行病學(xué)研究表明，砷暴露與不良生殖/發(fā)育結(jié)果有關(guān)[1]。此外，妊娠時(shí)砷暴露引起胎鼠出生體重、存活率降低，自發(fā)性流產(chǎn)等發(fā)病率升高，但是砷暴露引起人類(lèi)疾病發(fā)生的機(jī)制尚不清楚[1-2]。由于存在致癌風(fēng)險(xiǎn)，目前我國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2006）已將砷限值提高至≤ 10μg/L（10 ppb）[3]。但目前GB 5749-2006標(biāo)準(zhǔn)中的低劑量砷對(duì)孕婦和嬰兒等易感人群的影響尚無(wú)共識(shí)[4]。本研究復(fù)制早期砷暴露小鼠模型，旨在觀察發(fā)育關(guān)鍵期低水平砷暴露對(duì)小鼠生長(zhǎng)、發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

C57BL/6J小鼠購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，交配前2周采用AIN-76A飼料喂養(yǎng)小鼠。檢測(cè)到小鼠交配受孕后，給予潔凈水（對(duì)照組）或10 ppb砷水（砷暴露組）飼養(yǎng)小鼠，直至其完成妊娠和哺乳，雄性小鼠交配前未暴露于砷。分娩后，砷暴露組母鼠進(jìn)一步分為3組：①出生后砷暴露組（A組，子代鼠出生后1～30 d暴露于10 ppb砷飲用水）；②子宮內(nèi)砷暴露組（B組，子代鼠出生前暴露于10 ppb砷飲用水）；③子宮內(nèi)和出生后砷暴露組（C組，子代鼠出生前至出生后30 d內(nèi)暴露于10 ppb砷飲用水）。從妊娠第18天開(kāi)始，監(jiān)測(cè)2次/d，密切觀察母鼠分娩情況。子代鼠出生后第22天斷奶，并根據(jù)分組飲用潔凈水或10μg/L砷水。妊娠期第15.5天或哺乳期間不同時(shí)間點(diǎn)處死部分母鼠，進(jìn)行尸檢；產(chǎn)后第10、22和42天處死部分子代鼠，進(jìn)行尸檢。將各組部分（3～6只）小鼠置于代謝籠飼養(yǎng)24 h，在指定時(shí)間點(diǎn)收集尿液，并測(cè)定飲用水?dāng)z入量。

1.2 砷暴露

將亞砷酸鈉溶于滅菌雙蒸水配制成10 ppb濃度的飲用水。采用高效液相色譜儀檢測(cè)最終溶液中的砷濃度，飲用水更換2次/周。

1.3 記錄子代鼠生長(zhǎng)情況

母鼠分娩時(shí)，記錄幼崽長(zhǎng)度、幼崽數(shù)量、平均幼崽重量（平均幼崽重量=所有幼崽總重/幼崽數(shù)）、死亡幼崽數(shù)和畸形幼崽數(shù)。產(chǎn)后記錄子代鼠重量（g）至 28 d。

1.4 肝臟組織HE染色

不同時(shí)間點(diǎn)處死母鼠和子代鼠后，游離肝臟，用甲醛（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司）固定后，石蠟包埋切片，行HE染色（武漢博士得公司）。

1.5 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

產(chǎn)后10～12 d，將母鼠與幼鼠分離6 h使母乳積聚。按照0.1 ml/30 g體重的比例，肌內(nèi)注射氯胺酮-甲苯噻嗪混合物（9∶1）麻醉母鼠，同時(shí)注射1 ml催產(chǎn)素。通過(guò)手刺激小鼠乳頭擠奶，用移液管收集。母乳儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。母乳用PBS稀釋，采用二喹啉甲酸蛋白含量測(cè)定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）測(cè)定母乳中蛋白質(zhì)濃度。

1.6 三酰甘油的檢測(cè)

采用自動(dòng)生化儀（日本奧林巴斯公司）測(cè)定母鼠母乳（1∶160稀釋）、肝組織勻漿（1∶20稀釋）和血清（1 ∶ 2 稀釋）中甘油三酯（Triglyceride, TG）的濃度。

1.7 電感耦合等離子體質(zhì)譜分析

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）（德國(guó)西門(mén)子公司）測(cè)量母乳（5只）、幼崽胃部（6只）、母鼠尿（3只）和胎盤(pán)（3只）中微量金屬總濃度。胎盤(pán)、胃和母乳樣品在70℃條件下用0.3～0.5 ml最適HNO3消化，然后加入0.05～0.10 ml雙氧水H2O2，并將消化樣品稀釋至3 ml（胃和母乳）或5 ml（胎盤(pán)）終體積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，比較用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分娩結(jié)果

對(duì)照組產(chǎn)仔數(shù)（7.5±0.3）只，砷暴露組（7.4±0.3）只，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.341，P=0.336）。對(duì)照組孕齡（20.2±0.3）d，砷暴露組（19.6±0.4）d，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.942，P=0.573）。對(duì)照組幼崽（包括存活和死亡）平均重量（1.28±0.01）g，砷暴露組（1.26±0.02）g，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.963，P=0.566）。以上研究結(jié)果提示，對(duì)照組和砷暴露組分娩結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 子代鼠生長(zhǎng)情況

出生后第10天對(duì)照組及A、B、C組小鼠體重分 別 為（5.33±1.82）、（3.54±0.93）、（3.82±1.04）和（4.01±1.16）g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.782，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，A、B、C組子代鼠體重均低于對(duì)照組（P＜0.05）；而A、B、C組間子代鼠體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明出生后第10天砷暴露組（A、B、C組）子代鼠生長(zhǎng)減緩。見(jiàn)圖1。

出生后第22天（斷奶時(shí)）對(duì)照組及A、B、C組小鼠體重分別為（10.84±1.32）、（7.01±1.14）、（8.23±1.35）和（7.28±1.17）g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=973.614，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，A、B、C組子代鼠體重均低于對(duì)照組（P＜0.05），而A、B、C組間子代鼠體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明出生后22天砷暴露組（A、B、C組）子代鼠生長(zhǎng)減緩。見(jiàn)圖1。

圖1 砷暴露對(duì)子代鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響 （±s）

2.3 胎盤(pán)、母乳、幼崽胃和尿砷濃度比較

砷暴露組胎盤(pán)、母乳和幼崽胃砷含量接近檢出限值。對(duì)照組未受孕小鼠尿砷含量（11.5±5.2）μg/L，暴露組（56.0±13.1）μg/L，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.913，P=0.000）（見(jiàn)圖 2）。

受孕第15.5天時(shí)，B組胎盤(pán)砷含量（1.2±0.4）ng/g，對(duì)照組（1.0±0.5）ng/g，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.974，P=0.351）（見(jiàn)圖 3A）。受孕第 15.5天時(shí)，B組母鼠尿砷含量（26.7±6.9）μg/L，對(duì)照組（6.9±2.5）μg/L，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.715，P=0.000），B 組母鼠尿砷含量高于對(duì)照組（見(jiàn)圖3B）。

出生后第10天，對(duì)照組及A、B、C組幼崽胃砷 含 量 分 別 為（0.6±0.3）、（2.1±0.5）、（0.9±0.4）及（2.7±1.0）ng/g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.412，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，A、C組幼崽胃砷含量高于對(duì)照組（P＜0.05）（見(jiàn)圖4A）。對(duì)照組及A、B、C組母乳砷含量分別為（1.66±0.7）、（1.72±0.43）、（1.58±0.34） 及（1.62±0.57）ng/g，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.444，P=0.971）（見(jiàn)圖 4B）。出生后第 10天，對(duì)照組及A、B、C組母鼠尿砷含量分別為（4.83±1.12）、（6.13±1.37）、（18.24±2.82）、（19.33±1.97）μg/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=137.641，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，B、C組母鼠尿砷含量高于對(duì)照組（P＜0.05）（見(jiàn)圖 4C）。出生后第22天，對(duì)照組及A、B、C組幼崽胃砷含量分 別 為（4.72±1.34）、（5.14±1.28）、（4.83±1.08）、（4.58±0.94）ng/g，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.197，P=0.882）（見(jiàn)圖 4D）。

圖2 對(duì)照組與砷暴露組未受孕小鼠尿砷含量比較 （±s）

2.4 母乳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)改變

母乳喂養(yǎng)的砷暴露組幼崽體重在出生后早期（出生后前10天）增加不明顯，出現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷，可能與母乳成分改變有關(guān)。4組母乳總蛋白含量比較，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4組母乳T(mén)G比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，砷暴露組母乳T(mén)G濃度低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)附表。

2.5 砷對(duì)母鼠和子代鼠肝臟脂肪變性的影響

妊娠第15.5天時(shí)，砷暴露組母鼠脂肪肝發(fā)生率為55.5%（5/9），對(duì)照組母鼠為0.0%（0/9），經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029），砷暴露組脂肪肝發(fā)生率高于對(duì)照組。肝脂肪變性經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診（見(jiàn)圖5A、B）。所有暴露組小鼠出生后第22天時(shí)未觀察到肝脂肪變性，表明砷對(duì)肝的影響是暫時(shí)的（見(jiàn)圖5C、D）。

圖3 對(duì)照組與B組子鼠受孕第15.5天砷含量比較 （±s）

圖4 母鼠和子代鼠不同組織樣本的砷含量比較 （±s）

圖5 孕期砷暴露對(duì)母鼠肝臟脂肪變性的影響 （HE×200）

附表 低水平砷暴露對(duì)母乳營(yíng)養(yǎng)成分的影響（n =5，mg/ml，±s）

附表 低水平砷暴露對(duì)母乳營(yíng)養(yǎng)成分的影響（n =5，mg/ml，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 總蛋白 TG對(duì)照組 203.4±16.7 6 247±118 A 組 218.3±12.6 2 893±109?B 組 209.8±11.3 3 047±114?C 組 216.4±13.4 2 678±273?F值 2.475 24.928 P值 0.077 0.000

3 討論

本研究表明，宮內(nèi)接觸我國(guó)飲用水最高標(biāo)準(zhǔn)量的砷暴露對(duì)母鼠和子代鼠的影響時(shí)間極為短暫，主要影響包括子代鼠生長(zhǎng)減緩、母鼠TG水平和成分改變、母乳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降低（特別是TGs）等。與對(duì)照組相比，砷暴露組胎盤(pán)砷水平未增加，可能是因?yàn)樯楸┞督M的砷可大量通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)移，但該動(dòng)物模型使用砷水平較低，ICP-MS的檢出范圍有限，影響了砷的檢測(cè)值。人體暴露模型和高劑量砷暴露小鼠模型研究證實(shí)砷通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)移[5]。本研究還觀察到所有砷暴露組中，攝入相同水平的砷，母體在妊娠期和產(chǎn)后期排泄的砷較未受孕小鼠減少。最近流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，妊娠可以顯著改變砷代謝，因?yàn)樾∈髮?duì)砷的新陳代謝非常高效[6-8]。本研究結(jié)果顯示，妊娠期小鼠尿中砷含量可能不是飲用水砷暴露水平的準(zhǔn)確標(biāo)志。

與預(yù)期不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量砷暴露影響子代鼠生長(zhǎng)發(fā)育。既往研究表明，高劑量砷暴露大鼠模型[10、50和100 mg/L]影響子代鼠生長(zhǎng)發(fā)育，而ppb和ppm級(jí)砷水平暴露并未影響子代鼠早期體重變化[9-11]。本研究還發(fā)現(xiàn)這些影響是暫時(shí)的，可以通過(guò)干預(yù)加以改善，表明本實(shí)驗(yàn)和其他研究相似的模型暴露時(shí)間和實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的不同會(huì)影響觀察結(jié)果。此外，本研究并未發(fā)現(xiàn)合并暴露期（即宮內(nèi)+產(chǎn)后）比單一暴露期（宮內(nèi)或產(chǎn)后）的影響更大，因此，本研究結(jié)果并不能排除小鼠對(duì)低劑量砷暴露可能存在一定的適應(yīng)能力。根據(jù)本研究結(jié)果，砷能夠引起子代鼠生長(zhǎng)發(fā)育缺陷，其原因可能與母鼠乳汁營(yíng)養(yǎng)成分改變有關(guān)。然而，本實(shí)驗(yàn)不能明確排除母體一些行為的改變?cè)谟揍膛嘤^(guò)程中不會(huì)引起生長(zhǎng)缺陷。本研究結(jié)果表明，砷暴露會(huì)對(duì)母乳成分和質(zhì)量產(chǎn)生影響，即使砷沒(méi)有直接通過(guò)母乳分泌和轉(zhuǎn)移。既往研究報(bào)道，成年小鼠在亞致死性流感和砷綜合暴露下，可增加呼吸道感染的嚴(yán)重程度[12]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)砷暴露母乳有脂蛋白的改變和肝臟的脂肪變性。

總之，本研究表明，宮內(nèi)或產(chǎn)后低水平砷暴露會(huì)產(chǎn)生許多直接的不利影響，包括TG和脂質(zhì)水平改變，子代鼠生長(zhǎng)缺陷，提示影響砷暴露易感人群的砷水平可能低于目前飲用水最高標(biāo)準(zhǔn)（10 ppb）。