EGCG對β-胡蘿卜素乳液物理穩(wěn)定性的影響

劉 蕾 陳歷水 馬 鶯 高彥祥

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司品牌食品研發(fā)中心， 北京 102209； 2.哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院， 哈爾濱 150090；3.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

0 引言

β-胡蘿卜素是一種脂溶性類胡蘿卜素，具有合成維生素A、猝滅單線態(tài)氧和使自由基失活等多種生物學功能。但由于β-胡蘿卜素在水中的溶解度低，熔點高，在光和熱的環(huán)境中容易發(fā)生化學降解等性質(zhì)限制了其在食品工業(yè)中的應用。利用水包油的乳液傳遞β-胡蘿卜素是一種成本較低，可以提高其水溶性、穩(wěn)定性及生物利用率的方法[1-2]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶葉茶多酚中含量最高同時抗氧化活性最強的物質(zhì)。乳蛋白和茶多酚可以多種方式進行相互作用，形成的復合物對乳液的物理及化學穩(wěn)定性都有一定的影響。RASHIDINEJAD等[3]研究了EGCG對牛奶脂肪球穩(wěn)定性的影響，實驗中利用離心的方法將牛奶的脂肪球從牛奶中分離出來后溶解在緩沖溶液中，利用相同的緩沖溶液將EGCG加入只含有脂肪球的乳液中，EGCG顯著改變了乳脂肪球的粒徑和zeta-電位；并利用透射電鏡和傅里葉紅外光譜研究了EGCG和乳脂肪球膜的相互作用，結果表明，EGCG可以與乳脂肪球膜的疏水區(qū)和親水區(qū)相互作用。DI MATTIA等[4]將茶多酚加入以β-乳球蛋白和吐溫20為復合乳化劑的乳液中，結果表明，茶多酚可以結合到油水界面上，茶多酚添加量越多，界面張力越小，茶多酚使油滴粒徑變大但并沒有影響乳液中的油脂氧化。

本文在不同pH值的β-胡蘿卜素乳液中添加不同含量的EGCG，測定EGCG對乳液物理穩(wěn)定性(粒徑、電位、包埋率和快速穩(wěn)定性)的影響。為研究EGCG對乳液穩(wěn)定性的影響機理，同時測定界面蛋白含量、α-乳白蛋白(α-LA)與EGCG混合溶液的濁度變化和熱力學參數(shù)指標，以期為EGCG作為抗氧化劑添加到β-胡蘿卜素乳液中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-LA，購于美國Davisco公司，純度95%以上；EGCG，購于北京北實縱橫科技發(fā)展有限公司，純度99.5%以上；中鏈三酸甘油酯(Medium chain triacylglycerol, MCT)，購于奎斯特國際有限公司；30% β-胡蘿卜素-MCT 懸浮液，購于浙江醫(yī)藥有限公司新昌制藥廠；檸檬酸、磷酸氫二鈉、正己烷、碳酸鈉、磷酸、無水乙醇，購于北京化工廠，純度99.5%以上；考馬斯亮藍試劑、疊氮化鈉，購于美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

M-110型高壓微射流均質(zhì)機，美國Microfluidizer公司；Zatasizer Nano-ZS90型激光粒度儀，英國馬爾文公司；HD-1型高速乳化均質(zhì)機，北京華遠航實驗設備廠；UV-1800型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；TurbiscanLab Expert 濃縮體系穩(wěn)定性分析儀，法國Formulaction 公司；RC2-S型超高速離心機，美國Sorvall 儀器公司；S22-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；2100N型濁度計，美國HACH公司；Nano型等溫滴定量熱儀，美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1β-胡蘿卜素乳液制備

將質(zhì)量分數(shù)1.5%的α-LA溶解于0.1 mol/L pH值2.0或pH值7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，在室溫(20℃)下攪拌4 h至α-LA全部溶解，待用。將30%的β-胡蘿卜素-MCT懸浮液加熱溶解于MCT中至其完全溶解待用，溶解方法參照XU等[5]的方法，并做了一定的調(diào)整。

在高速剪切儀的攪拌下將溶解有β-胡蘿卜素的MCT緩慢加入α-LA溶液中，12 000 r/min剪切10 min，形成粗乳液。將制備的粗乳液進一步通過微射流(82.7 MPa)均質(zhì)，循環(huán)3次[6]。由此制備的β-胡蘿卜素乳液(10%油相(含有0.5%β-胡蘿卜素)，1.5% α-LA)用于后續(xù)實驗。

取制備好的β-胡蘿卜素乳液與不同濃度的EGCG緩沖溶液等質(zhì)量混合。乳液中各組分的最終質(zhì)量分數(shù)為：MCT 5%(其中含有0.5%β-胡蘿卜素)，α-LA 0.75%。pH值2.0乳液中EGCG添加量：0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%、0.020 0%、0.050 0%、0.100 0%、0.200 0%、0.400 0%、0.500 0%；pH值7.0乳液中EGCG添加量：0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%、0.020 0%、0.050 0%、0.100 0%。

1.3.2乳液粒徑和電位測定

測定β-胡蘿卜素乳液粒徑分布(Polydispersity index,PDI)、z-平均粒徑和zeta-電位，基于動態(tài)光散射原理進行粒徑和電位分析。在粒徑和電位測定之前，利用與制備β-胡蘿卜素乳液相同的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH值2.0和pH值7.0)將乳液稀釋，以避免由于液滴濃度過大而引起的多重散射效應影響測定結果。在最終的測定溶液中乳液液滴質(zhì)量分數(shù)應小于0.005%[7]。

1.3.3乳液包埋率測定

β-胡蘿卜素乳液包埋率測定方法參照SURH等[8]的方法并進行一些調(diào)整。在1.0 mL的乳液中加入3.0 mL的正己烷，振蕩30 s。混合均勻后在離心力10 000g條件下離心5 min。取上清液于10 mL容量瓶中用正己烷定容。在450 nm下測定β-胡蘿卜素的吸光度。根據(jù)標準曲線計算出β-胡蘿卜素的含量。由此測出的含量即為未被包埋的β-胡蘿卜素的含量。包埋率計算公式為

式中A——包埋率，%

C1——未被包埋的β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度，mg/mL

C0——β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度，mg/mL

1.3.4乳液快速穩(wěn)定性測定

本實驗對β-胡蘿卜素乳液的快速穩(wěn)定性進行了分析。Turbiscanlab Expert濃縮體系穩(wěn)定性分析儀采用脈沖近紅外光源(波長λ=880 nm)自下而上掃描樣品，兩個同步光學探測器分別搜集透射光(Transmission，TM)和背散射光(Backscattering，BS)。在一定時間內(nèi)連續(xù)對樣品進行掃描，即可獲得透射光和背散射光信號對樣品高度的函數(shù)曲線圖。每次掃描產(chǎn)生一條掃描曲線，在掃描時間內(nèi)對不同掃描曲線進行比較分析即可反映樣品中顆粒的運動趨勢，進而預測出乳液的穩(wěn)定性[9]。

β-胡蘿卜素乳液的樣品濁度高，透射光強度小。根據(jù)儀器規(guī)定，在樣品透光率小于0.2%時，即采用背散射光數(shù)據(jù)對樣品進行分析。在測定中，β-胡蘿卜素乳液的透光率小于0.1%，因此本實驗中采用背散射光的變化進行樣品穩(wěn)定性分析。因為影響掃描曲線的因素除了乳液自身因素之外還有環(huán)境因素，因此，不同樣品的背散射光曲線沒有可比性。在分析比較不同樣品的穩(wěn)定性時，通常采用背散射光強變化值(ΔBS值)。ΔBS值排除了系統(tǒng)誤差對樣品掃描曲線的影響，因此比較在相同掃描時間內(nèi)不同樣品ΔBS值可以對乳液的穩(wěn)定性進行預測[10]。

1.3.5乳液界面α-LA含量測定

為了測定界面蛋白含量，通過超高速離心法將乳液中游離相α-LA與界面α-LA分離，參照FARAJI等[11]的方法。將乳液置于10 mL的超高速離心管中，在超高速離心機中離心50 min，離心力為36 000g。為避免β-胡蘿卜素在離心過程中發(fā)生氧化，將離心機溫度設定在10℃。離心結束后，利用帶有長針頭的注射器小心分離下層清液和上層乳析層。

取一定體積的下清液通過0.1 μm聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜進行過濾，去掉較大液滴乳析層顆粒[12]。取一定量過濾后的下層清液，利用考馬斯亮藍法測定下清液中蛋白含量[13]。

1.3.6溶液制備

α-LA溶液：將1.5%α-LA溶解在0.1 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH值7.0)中，室溫下攪拌4 h，使α-LA完全溶解，待用。

EGCG溶液：將1.0%EGCG溶解在0.1 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH值7.0)中，超聲處理2 min，并在室溫下攪拌10 min，使EGCG完全溶解。室溫下，EGCG在pH值7.0的緩沖溶液中容易發(fā)生氧化，因此EGCG溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。將1.0%的EGCG溶液進行不同倍數(shù)的稀釋得到不同濃度的EGCG溶液用于后續(xù)實驗。

α-LA與EGCG混合溶液：將1.5%的α-LA溶液與等質(zhì)量的不同濃度的EGCG溶液混合，混合溶液中α-LA質(zhì)量分數(shù)為0.75%，EGCG質(zhì)量分數(shù)為0、0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%、0.020 0%、0.050 0%、0.100 0%、0.200 0%、0.400 0%、0.500 0%。溶液混合1 h后，進行粒徑和濁度的測定[14]。

1.3.7溶液濁度測定

利用濁度儀測定α-LA與EGCG混合溶液的濁度。濁度儀的光學系統(tǒng)包括一套(870±30) nm光發(fā)射二極管(LED)裝置、一個90°散射光檢測器和一個LED檢測器。測量過程中，由光源發(fā)出平行的光束通過溶液，其中一部分光被吸收和散射，另一部分透過溶液。利用90°散射光檢測器進行散射光檢測。入射光恒定的條件下，在一定濁度范圍內(nèi)，散射光強度與溶液的渾濁度成正比，測量時選擇散射光濁度單位(Nephelometric turbility units, NTU)模式，測量溫度為25℃。

1.3.8α-LA與EGCG相互作用程度測定

等溫滴定量熱技術(Isothermal titration calorimetry,ITC)是一種利用反應熱量變化表征反應進行程度的技術。測定反應過程中熱量的變化，建立反應物質(zhì)總體的濃度變化與反應熱量變化之間的函數(shù)，并結合一定的數(shù)學模型，計算熱力學參數(shù)。微量熱等溫滴定技術具有靈敏度高、實時在線的特點，并且測量儀器具有差熱功率補償系統(tǒng)，可快速平衡熱量以便連續(xù)滴定。通過ITC實驗，可同時獲得多個熱力學參數(shù)，如吉布斯自由能變化量ΔG、反應焓變ΔH、反應熵變ΔS及結合常數(shù)K。

本實驗中應用ITC測定EGCG與α-LA在連續(xù)滴定過程中的熱量變化。實驗在25℃條件下進行。在進行實驗之前，將EGCG溶液和α-LA溶液進行過濾(0.45 mm水系膜)，過濾完成后進行真空脫氣。取脫氣完全的α-LA溶液300 μL注入樣品池中，50 μL的EGCG溶液置于注射器中。在滴定之前，先將儀器平衡3 600 s。待儀器平衡后，300 s后開始滴定，在滴定過程中，設置溫度為25℃，注射器攪拌速率為300 r/min，反應時間間隔為300 s。每滴滴定液的體積為2.0 μL，連續(xù)滴定25滴。對照實驗是將同樣濃度的EGCG溶液滴定到只含有緩沖溶液的樣品池中，將樣品的滴定曲線減去對照實驗的滴定曲線即為樣品實際熱量變化曲線。根據(jù)樣品的熱力學曲線，選擇合適的結合模型進行在線模擬，計算得到熱力學參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在所有實驗中，每個樣品設置3個平行樣品，并根據(jù)實驗結果計算平均值和標準差。實驗中使用GraphPad Prism 5 (美國GraphPad Software 公司)軟件，利用ANOVA方差分析和Turkey檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素乳液粒徑和電位

pH值是影響EGCG發(fā)揮抗氧化或促氧化作用的因素。 酸性環(huán)境增強了金屬離子的溶解性和穩(wěn)定性，使金屬離子可催化更多的氧化反應。隨著pH值的提高，EGCG的抗氧化活性增強，但金屬離子由于溶解度問題，其催化的氧化反應減少[15]。為了研究EGCG在β-胡蘿卜素乳液中發(fā)揮抗氧化/促氧化作用，制備了pH值2.0和pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液，研究不同pH值和EGCG添加量對β-胡蘿卜素乳液粒徑(z-平均粒徑)和電位(zeta-電位)的影響，實驗結果如表1所示。由于在pH值7.0的乳液中，當EGCG添加量大于0.1%時，乳液快速分層，無法得到穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液，因此沒有進行粒徑和電位的測定。

由表1可以得出，在pH值2.0的乳液中，EGCG的加入對β-胡蘿卜素乳液的粒徑?jīng)]有顯著影響(p>0.05)。SABOURI等[16]報道了將不同含量的EGCG(質(zhì)量分數(shù)0.05%～0.90%)添加到以酪蛋白為乳化劑的乳液中，EGCG添加量對乳液粒徑?jīng)]有顯著性影響。這與本實驗結果相同。在pH值7.0的乳液中添加不同含量的EGCG使乳液粒徑有顯著減小趨勢。EGCG的加入使α-LA的團聚狀態(tài)解離，使其更容易吸附到水油界面上，形成較小的液滴[17]，因此，本實驗中EGCG的加入使乳液粒徑減小可能是因為α-LA在團聚狀態(tài)時形成的乳液粒徑比較大，加入EGCG后使α-LA的團聚狀態(tài)解離，使其更容易吸附到水油界面上，形成了粒徑較小的液滴。不同pH值乳液中，β-胡蘿卜素乳液的粒徑有顯著性差異。其中pH值7.0的乳液粒徑顯著大于pH值2.0乳液的粒徑。這可能是因為α-LA在pH值2.0時，發(fā)生部分變性，形成熔球狀構型。相比在中性環(huán)境中的α-LA，pH值2.0的α-LA分子失去三級結構，結構變得更加松散，表面疏水性增加。這會使其表面活性增加，快速吸附到油滴界面上，在通過微射流的過程中，形成較小的液滴。

在pH值2.0和pH值7.0的乳液中，EGCG的加入沒有顯著影響β-胡蘿卜素乳液的電位(p>0.05)，此結果與SABOURI等[16]的結果相同。這主要是因為EGCG是不帶電荷的小分子物質(zhì)，因其自身不帶電荷，不會影響界面電位。有文獻報道EGCG可以通過疏水相互作用和氫鍵與乳蛋白相互作用[18-19]。但由于EGCG不帶電荷，在一定添加量的范圍內(nèi)，不能改變?nèi)橐旱碾娢?。在不同pH值條件下，β-胡蘿卜素乳液的電位有顯著性差異(p<0.05)。在pH值2.0時，乳液電位大于40 mV，而pH值7.0的乳液中，電位在-15 mV左右。這主要是因為α-LA的等電點pI值在4.0～5.0之間[17]，當乳液pH值為2.0時，低于其pI值，α-LA帶正電，同時因為蛋白變性使得更多的電荷暴露出來，使電位較高；當乳液pH值為7.0時，高于其pI值，α-LA帶負電荷，使乳液電位為負值。

表1 EGCG添加量對不同pH值β-胡蘿卜素乳液粒徑和電位的影響Tab.1 Influence of EGCG on particle size and zeta-potential of β-carotene emulsions at different pH values

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 β-胡蘿卜素乳液包埋率

乳液中β-胡蘿卜素的包埋率影響其生物利用率和貯藏穩(wěn)定性，因此在本實驗中測定不同EGCG添加量對β-胡蘿卜素乳液包埋率的影響，結果如圖1所示，圖中相同小寫、大寫字母分別表示pH值7.0、pH值2.0時沒有顯著性差異。

圖1 EGCG添加量對不同pH值β-胡蘿卜素乳液包埋率的影響Fig.1 Influence of EGCG on encapsulation rate of β-carotene emulsions at different pH values

從圖1中可得，在pH值2.0和pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液中，不同添加量的EGCG對β-胡蘿卜素的包埋率沒有顯著影響。茶多酚因分子內(nèi)含有多個苯環(huán)，具有一定的疏水性，而茶多酚分子中大量的羥基使其具有良好的水溶性[17]，因此，茶多酚可以結合到水油界面上，對α-LA有競爭性吸附或替代性吸附作用，進而影響β-胡蘿卜素乳液的包埋率。劉蕾等[20]報道了以α-LA為乳化劑的β-胡蘿卜素乳液中，α-LA的添加量為0.25%～3.00%時，單位界面面積上α-LA的質(zhì)量為3.1～5.5 mg/m2，因此，在乳液的水油界面上α-LA 發(fā)生了多層吸附。本研究中α-LA的添加量為0.75%時，在β-胡蘿卜素乳液的界面上，α-LA發(fā)生了多層吸附，EGCG可能與界面上多層蛋白的外層α-LA相互作用，并沒有與內(nèi)層界面蛋白發(fā)生競爭性吸附或替代性吸附。因此，EGCG的加入沒有影響乳液的包埋率。pH值2.0和pH值7.0乳液的包埋率之間沒有顯著性差異，進一步說明α-LA已經(jīng)完全覆蓋油滴界面，因此兩者包埋率之間沒有顯著差異。

2.3 β-胡蘿卜素乳液快速穩(wěn)定性

利用Turbiscan Lab Expert濃縮體系穩(wěn)定性分析儀進行乳液快速穩(wěn)定性分析，是在一定時間內(nèi)對乳液進行多次掃描，得到乳液的背散射光掃描曲線，根據(jù)掃描曲線的變化進行乳液的快速穩(wěn)定性分析。對pH值2.0乳液的掃描曲線分析可得，乳液中部的背散射光值(BS值)隨著掃描時間的延長逐漸增大，而乳液下部和上部的BS值沒有明顯變化。因此，對于pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液，其在貯藏過程中乳液液滴發(fā)生絮凝或聚集現(xiàn)象，使乳液粒徑增大，當乳液粒徑增大到一定程度時會發(fā)生分層現(xiàn)象，引起乳液失穩(wěn)[21-22]。

由于pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液的失穩(wěn)機理是乳液液滴發(fā)生團聚，因此，分析ΔBS值時選擇乳液中部背散射光變化值。不同EGCG添加量的pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液在掃描過程中ΔBS值隨掃描時間的變化如圖2所示。從圖2可以得出，pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液在55℃的掃描過程中，ΔBS值呈增大趨勢，這說明乳液中液滴的團聚速率逐漸增大，即乳液的物理穩(wěn)定性變差。當EGCG添加量小于0.2%時，乳液的ΔBS值與未添加EGCG乳液的ΔBS值沒有顯著性差異；當EGCG添加量大于0.2%時，乳液ΔBS值顯著大于未添加EGCG乳液的ΔBS值，表明當EGCG添加量大于0.2%時，乳液的物理穩(wěn)定性受EGCG添加的影響呈降低趨勢。

圖2 EGCG添加量對pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液掃描過程中ΔBS值的影響Fig.2 Influence of EGCG on ΔBS of β-carotene emulsions during scan procedure at pH value of 2.0

對pH值7.0的乳液進行掃描，乳液下部的BS值減小同時上部的BS值增加，中部的BS值沒有明顯變化。這主要是因為乳液發(fā)生了乳析現(xiàn)象即油滴上浮現(xiàn)象。當乳液發(fā)生乳析現(xiàn)象時，液滴的上浮導致乳液上部的背散射光值增大，同時引起乳液下部出現(xiàn)澄清，因此，乳液下部的背散射光值減小，更多的光可以通過樣品而不發(fā)生散射。

由于pH值7.0的乳液在貯藏過程中易發(fā)生乳析，所以乳液上部的ΔBS值的變化比較大，可以代表乳液的不穩(wěn)定現(xiàn)象。因此，在分析pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液的ΔBS值時選擇乳液上部的背散射光變化值。pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液ΔBS值隨掃描時間的變化如圖3所示。從圖中可以得出，在55℃的掃描過程中乳液的ΔBS值逐漸增大，這說明乳液的油滴上浮速率逐漸增大。同時當EGCG添加量為0.002 5%～0.020 0%時，添加了EGCG的β-胡蘿卜素乳液比未添加EGCG乳液的ΔBS值??；在此添加量范圍內(nèi)，隨著EGCG添加量的增加，ΔBS值逐漸增大，這說明雖然EGCG的添加使β-胡蘿卜素乳液的物理穩(wěn)定性提高，但隨著EGCG添加量的增加，乳液物理穩(wěn)定性仍呈下降趨勢；當EGCG添加量為0.05%和0.10%時，添加了EGCG的乳液的ΔBS值比未添加EGCG的乳液的ΔBS值大。這說明當有大量EGCG添加到β-胡蘿卜素乳液中時會使乳液的物理穩(wěn)定性顯著變差。

圖3 EGCG添加量對pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液掃描過程中ΔBS值的影響Fig.3 Influence of EGCG on ΔBS of β-carotene emulsions during scan procedure at pH value of 7.0

從以上結果中可以得出，將EGCG添加到pH值2.0和pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液中，對乳液穩(wěn)定性的影響不同。當將EGCG添加到pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液中時，當添加量大于0.2%時，會引起乳液穩(wěn)定性的顯著性下降；而將EGCG添加到pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液中時，當添加量為0.002 5%～0.020 0%時，EGCG的添加使β-胡蘿卜素乳液的物理穩(wěn)定性提高，當EGCG添加量大于0.02%時，EGCG的添加使β-胡蘿卜素乳液的物理穩(wěn)定性下降。

為了比較在相同EGCG添加量時不同pH值乳液的穩(wěn)定性，計算了不同pH值乳液的TSI(Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù))值，結果如表2所示。從表中可得，pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液的TSI值顯著高于pH值2.0的β-胡蘿卜素乳液的TSI值，說明在乳液中添加相同含量的EGCG時，pH值2.0的乳液的穩(wěn)定性高于pH值7.0的乳液。這可能是因為pH值2.0的乳液中α-LA變性，乳化性質(zhì)提高，致使制備乳液的物理穩(wěn)定性提高[17]。

表2 pH值2.0和pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液在掃描過程中TSI值比較Tab.2 Comparison of Turbiscan stability index (TSI) of β-carotene emulsions at different pH values

注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.4 β-胡蘿卜素乳液界面α-LA含量

利用超高速離心法，將乳液中β-胡蘿卜素油滴和連續(xù)水相分開，由于水相中既含有α-LA同時又含有EGCG，為了在測定α-LA時不受EGCG的干擾，選擇考馬斯亮藍法測定水相中α-LA含量。利用總的α-LA添加量減去水相中α-LA含量即可得到界面α-LA含量。

界面α-LA含量如圖4所示。在pH值2.0的乳液中，當EGCG添加量小于0.1%時，EGCG的添加量對界面α-LA含量沒有顯著影響(p>0.05)。當EGCG添加量大于0.1%時，隨著EGCG添加量的增加，界面α-LA含量呈下降的趨勢(p<0.05)。這可能是因為雖然在利用考馬斯亮藍法測定蛋白含量時不受多酚的影響，但當EGCG添加量比較高時(大于0.1%)，測定結果可能會受到EGCG含量的影響。因此當EGCG添加量高于0.1%時，界面α-LA含量逐漸減少可能是由EGCG干擾所致。在pH值7.0的乳液中，隨著EGCG添加量的增加，界面α-LA含量逐漸降低，這可能與EGCG干擾有關。

圖4 β-胡蘿卜素乳液中EGCG添加量對界面α-LA含量的影響Fig.4 Influence of EGCG on interfacial α-LA concentration of β-carotene emulsions at different pH values

比較pH值7.0和pH值2.0的界面α-LA含量可以得出，pH值7.0乳液中，界面α-LA含量顯著高于pH值2.0乳液體系中的界面α-LA含量，其中pH值2.0乳液中，界面α-LA質(zhì)量濃度為0.94～1.94 mg/mL；pH值7.0乳液體系中，界面α-LA質(zhì)量濃度為1.81～2.22 mg/mL。這可能是因為雖然pH值2.0體系中α-LA的表面疏水性比pH值7.0的α-LA大，但pH值2.0體系中電位是pH值7.0體系中電位的3倍左右，使得α-LA結合到界面上的阻力增加，由于電位的阻力可能大于表面疏水性的作用，使得pH值2.0體系中界面α-LA含量小于pH值7.0體系的界面α-LA含量[23-24]。

2.5 α-LA溶液粒徑

將EGCG作為抗氧化劑添加到pH值7.0以α-LA為乳化劑的β-胡蘿卜素乳液中時，當EGCG添加量大于0.1%時，乳液快速分層，不能得到穩(wěn)定的乳液。為了研究pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液中添加大量EGCG導致乳液穩(wěn)定性急劇下降的機理，將研究體系簡化，研究了在α-LA溶液中添加不同含量的EGCG對α-LA性質(zhì)的影響。

在溶液中添加不同含量的EGCG對α-LA粒徑的影響如圖5所示。從圖5a可以看出，當EGCG添加量為0.002 5%～0.050 0%時，隨著EGCG添加量的增加，α-LA粒徑?jīng)]有顯著性變化(p>0.05)；但與未添加EGCG的α-LA溶液粒徑相比，添加了EGCG的溶液的粒徑比未添加EGCG的α-LA粒徑小(p<0.05)。這可能是因為在溶液中，α-LA呈團聚狀態(tài)，當少量EGCG加入之后，會使α-LA的團聚解離，使粒徑降低。此結果與前面加入EGCG后使乳液粒徑減小相一致。

圖5 pH值7.0條件下不同EGCG添加量對α-LA溶液粒徑的影響Fig.5 Influence of EGCG on particle size of α-LA in solutions at pH value of 7.0

當EGCG添加量大于0.05%時，α-LA的粒徑先增大后減小，并顯著高于未添加EGCG和添加較少的EGCG溶液(0.002 5%～0.050 0%)的粒徑(p>0.05)(圖5b)。這主要是因為當EGCG添加量為0.1%時，溶液中顆粒粒徑增大，使溶液呈現(xiàn)渾濁的狀態(tài)，但并沒有引起快速的沉淀；當EGCG添加量繼續(xù)增大時，即添加量為0.2%～0.5%時，EGCG的加入使溶液快速產(chǎn)生沉淀。當測定產(chǎn)生沉淀的溶液粒徑時，測定的是上清液的粒徑，從而得到的溶液粒徑減小。

SHPIGELMAN等[26]報道了將EGCG加入β-乳球蛋白溶液中，隨著EGCG添加量的增加，兩者形成了粒徑較大的復合物，溶液發(fā)生渾濁；STASZEWSKI等[26]報道了茶多酚與β-乳球蛋白和酪蛋白肽的相互作用，研究了不同pH值和茶多酚添加量對復合物粒徑、電位和結構的影響。結果表明，在β-乳球蛋白在pH值4.5時與茶多酚形成了粒徑較大的復合物，而酪蛋白肽在pH值3.0時與茶多酚形成了粒徑較大的復合物。

在本實驗中，當EGCG添加量大于0.1%時，溶液粒徑增大，說明EGCG與α-LA發(fā)生了相互作用，形成了粒徑較大的復合物。當復合物粒徑繼續(xù)增大時，溶液產(chǎn)生沉淀。

2.6 α-LA溶液濁度

粒徑作為衡量溶液中顆粒大小的指標，可以表征EGCG的添加對α-LA粒徑的改變，或EGCG與α-LA形成復合物的粒徑[26]。濁度作為衡量溶液渾濁程度的指標，是一個宏觀的指標，不僅與溶液中不溶解物質(zhì)的濃度有關系，還與不溶解物質(zhì)的粒徑大小、形狀和折射指數(shù)有關[27]。

EGCG添加量對α-LA溶液濁度的影響如圖6所示。從圖中可得，隨著EGCG添加量的增加(0.002 5%～0.050 0%)，EGCG和α-LA的混合溶液的濁度逐漸增大。當EGCG添加量大于0.050 0%時，溶液濁度超過了濁度計的量程，說明在溶液中已經(jīng)形成了較大的顆粒。隨著EGCG添加量的增加，溶液的濁度逐漸增大，并產(chǎn)生沉淀。

圖6 pH值7.0條件下不同EGCG添加量對α-LA溶液濁度的影響Fig.6 Influence of EGCG on turbidity of α-LA solutions at pH value of 7.0

將不同含量EGCG加入蛋白溶液，當EGCG的添加量較少時，EGCG可以與蛋白通過疏水相互作用形成可溶性復合物，但當EGCG的添加量比較大時，EGCG可作為多齒配體，使蛋白形成二聚體。隨著EGCG的添加量繼續(xù)增多，蛋白之間以及蛋白-EGCG復合物之間的橋聯(lián)繼續(xù)增多，形成了粒徑較大的聚集體，甚至產(chǎn)生沉淀[27]。從本實驗結果中可以得出，當EGCG添加量低于0.05%時，EGCG與α-LA形成可溶性復合物；當EGCG添加量大于0.05%時，EGCG和α-LA形成了粒徑較大的聚集體，使溶液的粒徑和濁度增大。

未添加EGCG的α-LA溶液的濁度和EGCG添加量較小(0.002 5%～0.020 0%)時溶液的濁度相比較發(fā)現(xiàn)，后者的濁度比前者的濁度低，即少量EGCG的加入會使α-LA溶液的濁度降低，這與將少量EGCG(0.002 5%～0.020 0%)添加到α-LA溶液中使α-LA的粒徑減小相一致。

由α-LA溶液粒徑和濁度隨EGCG添加量的變化可得，當EGCG添加量大于0.1%時，EGCG的加入使α-LA發(fā)生沉淀，沒有足夠的α-LA作為乳化劑穩(wěn)定β-胡蘿卜素，從而引起乳液的迅速失穩(wěn)。

2.7 α-LA與EGCG相互作用熱力學參數(shù)測定

在溶液中蛋白可以與EGCG相互作用，形成非共價復合物[26]。為了研究α-LA與EGCG相互作用機理，采用等溫滴定量熱儀測定了α-LA與EGCG的相互作用程度。α-LA與EGCG在相互作用過程中的熱量變化如圖7所示，圖中Q、t、ΔQ分別代表熱量、時間、熱量變化值。圖中表示EGCG滴定到樣品池中的α-LA溶液后，補償熱功率隨著滴定數(shù)變化的熱功率曲線，每一個熱功率峰代表著每一次滴定過程。熱功率(dQ/dt)大于零表示反應為吸熱反應。

將每一次滴定產(chǎn)生的熱功率峰進行積分，減去對照的峰面積，即可求出在滴定過程中產(chǎn)生的熱量，如圖7所示。隨著滴定次數(shù)的增加，ΔQ絕對值先增加后減小，最終維持在0附近。當ΔQ不再改變時，表示反應達到平衡，生成物的量不再變化。結果顯示，反應的熱量變化與配體濃度能夠很好地符合多位點結合模型，因此，擬合的數(shù)據(jù)是有效的。在進行擬合時，第1個點的數(shù)據(jù)需要去掉，因為在第1次滴定前，等溫滴定量熱儀需要熱平衡1 h，在平衡過程中，注射器中的配體會產(chǎn)生擴散，部分配體已經(jīng)與樣品發(fā)生反應，第1次滴定的有效體積會減少[28]。

圖7 α-LA與EGCG相互作用的等溫滴定量熱測定Fig.7 Quantitative calorimetric determination of isothermal droplets under interaction of α-LA and EGCG

由表3可以得出，α-LA與EGCG的結合符合多位點結合模型，共有兩個結合位點。其中結合位點1的結合常數(shù)K1是結合位點2的結合常數(shù)K2的5.5倍，因此，在α-LA分子中結合位點1對EGCG的結合強度更高。兩個結合位點的反應焓變也存在顯著差異，其中結合位點1的焓變?yōu)檎?，而結合位點2的焓變?yōu)樨撝?，這主要是由結合位點1比結合位點2的結合強度高所致。由α-LA與EGCG的結合比例(α-LA和EGCG結合物質(zhì)的量之比)N1和N2可得，結合位點1中1分子α-LA可以與4分子EGCG結合；而結合位點2對EGCG的結合強度小，1分子α-LA可以與1分子EGCG結合。因此，在α-LA與EGCG的結合過程中，1分子α-LA可以與5分子EGCG結合。

表3 pH值7.0條件下ITC測定的α-LA與EGCG相互作用結果Tab.3 ITC analyses of EGCG reacting with α-LA at pH value of 7.0

將α-LA與EGCG混合溶液的粒徑和濁度數(shù)據(jù)與ITC數(shù)據(jù)相結合可以發(fā)現(xiàn)，當EGCG的添加量小于0.1%時，α-LA與EGCG的物質(zhì)的量之比小于1∶5，α-LA分子上有大量空閑的位置可以與EGCG結合；當EGCG添加量為0.1%時，α-LA與EGCG的物質(zhì)的量之比為1∶4，α-LA與EGCG結合的第1個位點已經(jīng)飽和，使α-LA溶液的粒徑開始變大，形成了粒徑比較大的非共價復合物，混合溶液的濁度開始增大。當EGCG添加量大于0.1%時，α-LA與EGCG的物質(zhì)的量之比大于1∶5，溶液中粒徑增大，并發(fā)生了沉淀。

3 結論

(1)EGCG添加量對pH值2.0和pH值7.0的乳液粒徑、電位和包埋率沒有顯著性影響。這與EGCG添加量沒有顯著影響界面α-LA含量有關。在pH值7.0的乳液中，添加了EGCG的乳液粒徑顯著小于未添加EGCG乳液的粒徑，這主要與EGCG的加入減少了α-LA分子間的團聚，促進其吸附到水油界面使乳液粒徑減小有關。

(2)在pH值2.0的乳液中添加小于0.2%的EGCG對乳液的快速穩(wěn)定性沒有顯著性影響，但當EGCG添加量大于0.2%時，隨著EGCG添加量的增大，乳液的穩(wěn)定性降低；將EGCG添加到pH值7.0的β-胡蘿卜素乳液中時，添加量小于0.02%時，乳液的穩(wěn)定性比未添加EGCG的乳液的穩(wěn)定性高，當EGCG添加量大于0.02%時，隨著EGCG添加量的增大，乳液的穩(wěn)定性降低。

(3)在pH值7.0乳液中添加EGCG使乳液迅速失穩(wěn)的機理中，隨著EGCG添加量的增加，EGCG與α-LA混合溶液的粒徑和濁度逐漸增大，當EGCG添加量大于0.1%時，混合溶液中形成了肉眼可見的復合物。通過ITC測定，α-LA與EGCG的反應是吸熱反應，在α-LA分子上有兩個位點可以與EGCG相結合。第1個位點的結合強度比較大，α-LA與EGCG的結合物質(zhì)的量之比為1∶4；第2個位點的結合強度比較小，α-LA與EGCG的結合物質(zhì)的量之比為1∶1。因此α-LA與EGCG的結合物質(zhì)的量之比為1∶5。在pH值7.0以α-LA為乳化劑的乳液中添加EGCG作為抗氧化劑時，其添加量需小于0.1%。