李姜惠子 劉 洋 王秀娟 孫明玲 龐楠楠 哈力達(dá)·亞森 趙 芳 秦玉婷 郭新紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心，新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所，烏魯木齊830000)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30%，以外周血血小板計(jì)數(shù)減少，伴或不伴皮膚黏膜出血為主要臨床表現(xiàn)，出血風(fēng)險(xiǎn)隨年齡的增長而增加，嚴(yán)重者可有內(nèi)臟出血甚至顱內(nèi)出血，危及生命[1]。該病發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，大量研究顯示細(xì)胞免疫功能紊亂在該病發(fā)病過程中起到重要作用[2-4]。程序性死亡受體1(PD-1)及其配體(PD-L1)是重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子，sPD-1/sPD-L1為其可溶性形式，以往研究發(fā)現(xiàn)其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、自身免疫性肝炎等多種自身免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮一定作用[5-7]，但在ITP疾病中所起的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過檢測初治ITP患者血清中sPD-1、sPD-L1與相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，并分析sPD-1與細(xì)胞因子的相關(guān)性，探討其在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2015年1月～2016年6月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心住院的ITP患者35例為研究對象，年齡16～66歲，中位年齡42歲，其中男性14名，女性21名。納入的病例均符合2016年版《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，所有患者均為初次發(fā)病，排除使用過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療者、1月內(nèi)接受過血小板輸注、施行過脾切除術(shù)者；同時(shí)選取20例同期體檢的健康者納入對照組，年齡16～65歲，中位年齡41歲，其中男性8名，女性12名，年齡、性別等均與病例組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，排除自身免疫性疾病、近期感染、腫瘤等疾病。所有受檢者在參與研究前均通過倫理委員會(huì)認(rèn)證，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集 收集35例ITP患者及20例正常對照組靜脈血樣本，低速離心機(jī)離心(2 500 r/min，10 min)，收集血清并分裝于1.5 ml EP管中，放置-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2ELISA法檢測血清中sPD-1、sPD-L1、IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平 sPD-1、sPD-L1、IFN-γ 、IL-4、IL-17及TGF-β的ELISA試劑盒均購于美國eBioscience公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。取出待測標(biāo)本室溫放置20 min，于各反應(yīng)孔依次加入50 μl 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、血清標(biāo)本、生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板后振蕩混勻，37℃溫育1 h，每孔用洗滌液人工洗滌3次，于各反應(yīng)孔加入親和鏈霉素-HRP 80 μl，振蕩混勻后于37℃溫育30 min，每孔用洗滌液人工洗滌3次，每孔加入50 μl的底物A、B，振蕩混勻后于37℃避光溫育10 min，取出酶標(biāo)儀，加入50 μl終止液，讀取酶標(biāo)儀450 nm處吸光度(OD)值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兩組標(biāo)本中sPD-1、sPD-L1、IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β的濃度。

1.2.3血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測血小板計(jì)數(shù) 采集35例ITP患者治療前及20例正常對照組空腹靜脈血樣本4 ml，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測血小板計(jì)數(shù)并對ITP患者血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行人工復(fù)檢，取清潔小試管1支加入血小板稀釋液0.38 ml，準(zhǔn)確吸取靜脈血20 μl置于血小板稀釋液內(nèi)，吸取上清液洗3次，立即充分混勻，待完全溶血后再次混勻1 min。取上述均勻的血小板懸液1滴，充入計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置10～15 min，用高倍鏡計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)四角和中央共五個(gè)中方格內(nèi)血小板數(shù)，根據(jù)五個(gè)中方格內(nèi)血小板計(jì)數(shù)×109/L計(jì)算每升血小板數(shù)。

2 結(jié)果

2.1初治ITP患者外周血中sPD-1、sPD-L1的表達(dá) 采用ELISA法分別檢測兩組血清中sPD-1、sPD-L1水平，初治ITP患者sPD-1水平高于對照組(P=0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；sPD-L1水平與對照組無明顯變化(P=0.107)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明ITP患者體內(nèi)存在sPD-1表達(dá)增高的現(xiàn)象(表1、圖1A)。

2.2初治ITP患者外周血中細(xì)胞因子的表達(dá) 采用ELISA法分別檢測35例初治ITP患者及20例對照組血清中IFN-γ、IL-4、IL-17與TGF-β水平，數(shù)據(jù)顯示初治ITP患者血清中IFN-γ、IL-17水平高于對照組(P=0.031、P=0.005)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-4、TGF-β水平低于對照組(P=0.028、P=0.042)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明ITP患者體內(nèi)存在Th1、Th17型細(xì)胞因子增多，Th2、Treg型細(xì)胞因子減少，T細(xì)胞亞群失衡的現(xiàn)象(表1、圖1A)。

2.3初治ITP患者sPD-1與細(xì)胞因子的關(guān)系 本研究采用ELISA法檢測出sPD-1在ITP患者血清中表達(dá)增高，IFN-γ、IL-17表達(dá)亦增高而IL-4、TGF-β表達(dá)降低。通過Pearson法分析初治ITP患者血清中sPD-1與IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β及血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性，數(shù)據(jù)顯示sPD-1與IFN-γ呈正相關(guān)(r=0.516,P=0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562,P=0.002)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與IL-4、IL-17、TGF-β無相關(guān)性(P均>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)(r=-0.531,P=0.004)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明sPD-1、IFN-γ的升高有可能在一定程度上參與了ITP疾病的發(fā)生(圖1B～D)。

ITP patients(n=35)Healthysubjects(n=20)PGender(Male/Female)14/218/12>0.05Median age(year)42(16-66)41(16-65)>0.05Platelet count(×109/L)17.6±12.2120.0±20.0sPD-1(pg/ml)106.80±32.561)83.57±21.690.008sPD-L1(pg/ml)63.77±20.8254.49±20.200.107IFN-γ(pg/ml)316.48±101.421)249.69±81.130.031IL-4(pg/ml)292.22±89.031)361.48±110.200.028IL-17(pg/ml)10.52±3.301)7.88±2.560.005TGF-β(pg/ml)2 601.70±703.781)3 121.56±938.840.042

Note：Compared with healthy group,1)P<0.05.

圖1 血清中相關(guān)因子表達(dá)水平及sPD-1與IFN-γ和血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性Fig.1 Levels of related factor in serum and correlation between sPD-1,IFN-γ and platelet count

3 討論

ITP是一種由于體內(nèi)免疫失衡所導(dǎo)致的自身免疫性疾病，其經(jīng)典的免疫機(jī)制是抗原特異性自身抗體介導(dǎo)的血小板被單核-巨噬細(xì)胞過度破壞，但仍有約1/3的患者無法檢測到自身抗體，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群的比例失衡及其分泌的細(xì)胞因子平衡紊亂參與了ITP發(fā)病過程[2-4]。

初始CD4+T細(xì)胞經(jīng)第一信號和共刺激信號激活后分化為效應(yīng)T細(xì)胞，通過多種細(xì)胞因子以及CD28/B7、CD40/CD154等協(xié)同刺激分子與自身反應(yīng)性B細(xì)胞相互作用，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化并大量產(chǎn)生自身抗體，進(jìn)而持續(xù)破壞血小板，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8]。PD-1/PD-L1屬于CD28/B7家族，是一種抑制T細(xì)胞增殖與細(xì)胞因子產(chǎn)生的負(fù)性調(diào)控因子[9]。sPD-1/sPD-L1為PD-1/PD-L1的可溶性形式[10]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清及滑膜中存在異常高表達(dá)的sPD-1，增高的sPD-1可能與mPD-L1發(fā)生結(jié)合，阻斷膜型PD-1/PD-L1信號通路對T細(xì)胞的抑制作用，引起機(jī)體免疫失控。研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中sPD-1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量顯著增高，血漿中sPD-1的表達(dá)也顯著增高[11]。我們的研究結(jié)果提示ITP患者血清中sPD-1水平高于對照組，這與上述研究結(jié)果基本一致。sPD-1可能通過抑制PD-1/PD-L1負(fù)性信號通路，減弱免疫抑制信號，從而參與ITP的發(fā)病機(jī)制[11]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)sPD-1與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，表明sPD-1升高與血小板破壞嚴(yán)重程度存在一定關(guān)系。

以往研究提示Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子的高表達(dá)與ITP疾病發(fā)病密切相關(guān)[12，13]。根據(jù)分泌細(xì)胞因子及功能的不同可將初始CD4+T細(xì)胞(Th0)分為不同的細(xì)胞亞群：Th1細(xì)胞主要分泌Th1型細(xì)胞因子，包括IFN-γ、TNF、IL-2等，發(fā)揮細(xì)胞免疫的效應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌Th2型細(xì)胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等，可輔助B細(xì)胞活化，產(chǎn)生漿細(xì)胞及自身抗體，發(fā)揮體液免疫的作用；Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞相互抑制、相互調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)ITP患者血清中IFN-γ水平升高，ITP可能屬于Th1優(yōu)勢應(yīng)答的免疫反應(yīng)[14，15]。本研究結(jié)果顯示ITP患者血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平升高，Th2型細(xì)胞因子IL-4水平降低，這與郭新紅等[14]研究結(jié)果基本一致，提示ITP患者體內(nèi)存在Th1/Th2比例失衡，Th1細(xì)胞免疫偏移的現(xiàn)象。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中sPD-1與IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)水平存在正相關(guān)，可能與疾病的嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。我們的研究結(jié)果提示ITP患者外周血中sPD-1與IFN-γ呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果基本一致，提示sPD-1升高能夠促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的分泌。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，IFN-γ升高可能在一定程度上與血小板破壞程度有關(guān)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在ITP中比例顯著增高，與Th1細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同作用[16]。Treg細(xì)胞數(shù)量減少和免疫抑制功能減弱在ITP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示ITP患者血清中IL-17水平升高，TGF-β水平降低。Yazdanbakhsh等[12]研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg比例失衡導(dǎo)致ITP患者體內(nèi)免疫失衡，可能參與了ITP疾病的發(fā)生。Th17細(xì)胞主要通過分泌特異性IL-17刺激多種細(xì)胞參與機(jī)體免疫防御，Treg可通過分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Th17型細(xì)胞因子升高，而Treg型細(xì)胞因子降低，提示Treg細(xì)胞的減少可能會(huì)打破機(jī)體的免疫平衡，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制功能減弱，T細(xì)胞異常激活，Th17/Treg失衡可能在ITP的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用。研究發(fā)現(xiàn)sPD-1與IL-17呈正相關(guān)，同時(shí)可抑制Treg細(xì)胞[5，18]。我們的結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)sPD-1與IL-17、TGF-β存在相關(guān)性，這與上述研究結(jié)果不一致，考慮可能在ITP患者體內(nèi)不只存在PD-1/PD-L1負(fù)性共刺激分子這一種調(diào)節(jié)機(jī)制，或存在其他調(diào)控因素混合影響，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討?？傊?，sPD-1與IFN-γ呈正相關(guān)，血小板計(jì)數(shù)與sPD-1、IFN-γ均呈負(fù)相關(guān)，提示增高的sPD-1可能通過抑制PD-1/PD-L1通路的負(fù)性調(diào)控作用，使Th細(xì)胞功能未受抑制，導(dǎo)致Th1細(xì)胞活性增高。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)在ITP患者體內(nèi)存在Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡、sPD-1表達(dá)水平升高的現(xiàn)象，增高的sPD-1可能通過抑制PD-1/PD-L1負(fù)性通路，導(dǎo)致T細(xì)胞亞群失衡。至于sPD-1對PD-1/PD-L1通路如何發(fā)揮作用，將進(jìn)一步通過完善體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。