宮頸癌組織中miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)變化及其意義

王宏，李娜，羅穎

(本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪117000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排第2位，全球每年約有50萬例新發(fā)病例，死亡例數(shù)達(dá)26萬例，中國(guó)每年新發(fā)病例達(dá)13萬，死亡例數(shù)約5萬例[1]。近年來新的治療模式及靶向藥物的發(fā)展，增加了宮頸癌的臨床治療療效，提高了患者的生活質(zhì)量[2]。但因腫瘤具有高度克隆異質(zhì)性和細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)的復(fù)雜性特點(diǎn)，目前抗腫瘤治療效果有限，中晚期宮頸癌患者的5年總體生存率僅約40%[3]。因而，有必要深入研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的診斷及治療的生物學(xué)靶點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度約18～25個(gè)核苷酸的RNA調(diào)控分子，其能與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，改變mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)mRNA降解，影響基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及分化等過程的調(diào)控[4]。近年來研究[5]表明，miR-181a通過抑制癌基因T細(xì)胞淋巴瘤斷點(diǎn)1(TCL1)的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在miR-181a低表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力增強(qiáng)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)，又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是熱休克蛋白70家族的成員。GRP78位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊和組裝，還參與內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)過程，可將新合成的多肽轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)被蛋白酶降解。近年來研究[6，7]表明，GRP78在胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達(dá)升高，可能與其激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲蘇氨酸激酶1(AKT)途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。有研究[8]報(bào)道，在宮頸癌腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-181a能調(diào)控GRP78基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成及奧沙利鉑耐藥性形成等過程。但目前，miR-181a與GRP78在宮頸癌中的調(diào)控機(jī)制及兩者之間的關(guān)系尚未明確，還需進(jìn)一步研究。本研究通過檢測(cè)宮頸癌組織中miR-181a與GRP78 mRNA的表達(dá)情況，分析兩者與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2016年3月本溪市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者93例，患者年齡31～73歲，平均(46.5±9.3)歲；其中鱗癌79例、腺癌14例，高分化25例、中分化37例、低分化31例，F(xiàn)IGO分期Ⅰ期51例、Ⅱ期42例[9]，淺肌層浸潤(rùn)40例、深肌層浸潤(rùn)53例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌診斷均經(jīng)活檢病理或術(shù)后病理確診；②既往未接受放化療、免疫治療等抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，患者及家屬均知情同意并已簽字。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它器官的惡性腫瘤；②既往有其它宮頸疾病如宮頸上皮內(nèi)瘤變或因?qū)m頸疾病手術(shù)治療的病史；③合并嚴(yán)重心肝肺腎等臟器功能不全。選取同期接受子宮切除術(shù)的子宮肌瘤患者40例，患者年齡33～58歲，平均(45.1±7.2)歲。兩組患者之間年齡無顯著差異(P>0.05)。患者均接受手術(shù)切除治療，術(shù)中留取宮頸癌組織或正常宮頸組織，迅速置于凍存管內(nèi)，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存?；颊叱鲈汉缶M(jìn)行門診或電話隨訪，記錄患者生存情況。隨訪終止日期為2019年3月，隨訪1～48個(gè)月，中位隨訪時(shí)間30.1個(gè)月。

1.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中miR-181a、GRP78 mRNA檢測(cè)及分析方法 采用qRT-PCR法。取30 mg組織標(biāo)準(zhǔn)，TRIzol法提取宮頸癌組織及正常宮頸組織中總RNA，并溶于RNAase-free的ddH2O中，分光光度測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度及純度。以2 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列如下：miR-181a上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCG-3′，下游引物為5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′，GRP78上游引物為5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′，下游引物為5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′，內(nèi)參基因U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中模板3μL，上下游引物各1 μL，SYBR premix Ex TaqⅡ 12 μL，加去離子水補(bǔ)足體系至20 μL。所有反應(yīng)均在ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以2-ΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。以宮頸癌組織中miR-181a、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為臨界值，將93例宮頸癌患者分為miR-181a高表達(dá)組、miR-181a低表達(dá)組和GRP78 mRNA高表達(dá)組、GRP78 mRNA低表達(dá)組，并分析miR-181a、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)比較 宮頸癌組織中miR-181a、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.524±0.105、1.208±0.340，正常宮頸組織中miR-181a、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.613±0.580、0.647±0.132，兩者相比，P均<0.05。

2.2 宮頸癌組織中miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 宮頸癌組織中miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.645，P=0.000)。

2.3 miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。表1顯示，miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者腫瘤FIGO分期、分化程度有關(guān)(P均<0.05)，而與年齡、病理類型、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。

表1 miR-181a、GRP78 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 miR-181a、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 以宮頸癌組織中miR-181a相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)0.524為臨界值進(jìn)行分組，其中miR-181a高表達(dá)組45例，miR-181a低表達(dá)組48例。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miR-181a高表達(dá)組3年總體生存率(OS)為84.4%(38/45)，miR-181a低表達(dá)組3年OS為79.1%(38/48)，兩組間患者3年OS相比，P>0.05。

以宮頸癌組織中GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)1.208為臨界值進(jìn)行分組，其中GRP78 mRNA高表達(dá)組46例，GRP78 mRNA低表達(dá)組47例。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，GRP78 mRNA高表達(dá)組3年OS為67.4%(31/46)，GRP78 mRNA低表達(dá)組3年OS為96.7%(45/47)，兩組間患者3年OS相比，P<0.05。

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，發(fā)展中國(guó)家女性發(fā)病率及死亡率高于發(fā)達(dá)國(guó)家，中年女性多見[10]。對(duì)宮頸癌的細(xì)胞學(xué)及人乳頭瘤病毒DNA的篩查，有助于宮頸癌的早期診斷，但對(duì)許多發(fā)展中國(guó)家來說，宮頸癌篩查的覆蓋率較低，宮頸癌死亡率仍居高不下。因此，深入研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的早期診斷、判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物對(duì)于宮頸癌的診斷治療具有重要的意義。

miRNA長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，miRNA的編碼基因在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄為初級(jí)miRNA，然后在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)miRNA前體，核糖核酸酶Ⅲ進(jìn)而將其剪切為成熟的miRNA后結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，與靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，改變mRNA的穩(wěn)定性，影響mRNA翻譯過程[11]。miR-181a是一種小非編碼RNA，其編碼基因位于染色體1q32.1，有一個(gè)外顯子。近年來研究[12]表明，miR-181a在乳腺癌等多種腫瘤中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，并且miR-181a在腫瘤增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中miR-181a的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常宮頸組織。我們認(rèn)為其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，可能與腫瘤發(fā)生時(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA癌癥易感性候選物基因2通過表觀遺傳學(xué)修飾抑制miR-181a基因表達(dá)有關(guān)，miR-181a表達(dá)降低后癌基因AKT表達(dá)增加，而抑癌基因磷酸酶-張力蛋白基因表達(dá)降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制凋亡[13]。本研究中，F(xiàn)IGO分期Ⅱ期、低分化癌組織中miR-181a相對(duì)表達(dá)量分別顯著低于FIGO分期Ⅰ期、高中分化癌組織中miR-181a水平，表明miR-181a參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程。其機(jī)制可能與miR-181a對(duì)Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子淋巴增強(qiáng)因子-1(LEF-1)基因的抑制作用減弱有關(guān)，LEF-1基因表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展，腫瘤分期分級(jí)增高[14，15]。本研究中進(jìn)一步分析不同miR-181a表達(dá)水平患者3年OS的差別，結(jié)果miR-181a高表達(dá)組與miR-181a低表達(dá)組患者3年OS無明顯差異，表明miR-181a不是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。分析其原因，一方面可能與本研究隨訪時(shí)間較短有關(guān)，我們可以延長(zhǎng)隨訪時(shí)間觀察miR-181a表達(dá)對(duì)宮頸癌患者生存預(yù)后的影響；另一方面，宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中受到多種miRNA表達(dá)調(diào)控，形成對(duì)癌基因和抑癌基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜的RNA網(wǎng)絡(luò)[16]。因此，有待深入研究宮頸癌中RNA表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制，指導(dǎo)臨床診斷和治療。

GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種應(yīng)激性蛋白，參與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生肽的聚集、調(diào)控異常折疊蛋白、維持細(xì)胞及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣穩(wěn)態(tài)的作用。近年來，在喉鱗狀細(xì)胞癌的研究[17]中，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞表面存在GRP78異常高表達(dá)的現(xiàn)象，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，宮頸癌組織中GRP78 mRNA明顯高于正常宮頸組織，表明宮頸癌組織GRP78 mRNA表達(dá)增加，其機(jī)制可能是腫瘤發(fā)生時(shí)抑制GRP78基因表達(dá)的微小RNA如miR-495、miR-199a-5p等表達(dá)降低，結(jié)合到GRP78 mRNA的3′端非編碼區(qū)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物減少，最終導(dǎo)致GRP78 mRNA表達(dá)增加[18]，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖信號(hào)通路(如PI3K/Akt)的活化、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶活化受到抑制等，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究中，宮頸癌組織中GRP78 mRNA的表達(dá)與FIGO分期、分化程度有關(guān)，F(xiàn)IGO分期越高、分化越差的癌組織中GRP78 mRNA水平越高，表明GRP78 mRNA參與腫瘤的發(fā)展，可作為反映腫瘤惡性程度的指標(biāo)。其原因是腫瘤發(fā)生時(shí)GRP78 mRNA促進(jìn)局部黏著斑激酶的活化，進(jìn)而激活JNK信號(hào)通路的活化，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的局部浸潤(rùn)能力[19]。本研究中，GRP78 mRNA高表達(dá)組3年OS明顯低于GRP78 mRNA低表達(dá)組，表明GRP78 mRNA有可能成為反映患者生存預(yù)后的分子生物學(xué)指標(biāo)。有研究[20]應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，GRP78 mRNA是miR-181a的重要作用靶點(diǎn)，miR-181a表達(dá)增加能夠直接抑制GRP78 mRNA表達(dá)。本研究中，miR-181a與GRP78 mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，表明miR-181a可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中存在調(diào)控GRP78 mRNA表達(dá)的作用。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-181a低表達(dá)、GRP78 mRNA高表達(dá)，miR-181a與GRP78 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-181a及GRP78 mRNA表達(dá)與FIGO分期、分化程度有關(guān)，兩者共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，有可能成為新的宮頸癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。GRP78 mRNA高表達(dá)的宮頸癌患者術(shù)后生存率低，GRP78 mRNA可能成為反映患者生存預(yù)后的分子生物學(xué)指標(biāo)。