姚佳烽 姜祝鵬 趙桐 王昊 陳柏 吳洪濤

摘?要?研究了多電極陣列微流控芯片內(nèi)不同細(xì)胞在介電泳力下的運(yùn)動(dòng)特征，對(duì)外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白不同的兩種細(xì)胞進(jìn)行了分離。多電極陣列微流控芯片在流道的5個(gè)正方形橫截面嵌入電極陣列，每個(gè)橫截面的一組對(duì)邊嵌入8根電極，此結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了微流道的尺寸，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在介電泳力的作用下高流量分離。為了研究微流控芯片內(nèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特征，首先通過電場(chǎng)數(shù)值分析，對(duì)一個(gè)橫截面內(nèi)多電極電場(chǎng)分布進(jìn)行了計(jì)算， 得到了最佳電極組合方式，使得電場(chǎng)分布均勻，且介電泳力最大。之后，通過實(shí)驗(yàn)分析了在不同頻率、多電極復(fù)雜電場(chǎng)下，外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白不同的人肺部成纖維細(xì)胞MRC-5的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)。通過對(duì)介電泳力的波譜進(jìn)行分析，得到了野生型（WT）和組蛋白-GFP型（GFP-HT）兩種細(xì)胞的分離頻率為f=30 kHz。最后，在兩個(gè)入口處通入不同比例的蔗糖（Sucrose）溶液與兩種細(xì)胞混合液，計(jì)算了細(xì)胞的分離率。當(dāng)兩個(gè)入口的流量比為12∶1時(shí)，兩種細(xì)胞的分離率可以達(dá)到93.5%。本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細(xì)胞的方法為細(xì)胞的高流量快速分離奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?介電泳; 細(xì)胞運(yùn)動(dòng); 多電極; 復(fù)合電場(chǎng); 最優(yōu)電極組合; 微流控芯片

1?引 言

微流控芯片能夠在單個(gè)緊湊裝置中實(shí)現(xiàn)多種功能，如細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)和裂解分析[1～3]， 目前，有多種微流控芯片可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離[4，5]。利用微流體裝置進(jìn)行免標(biāo)記高速細(xì)胞操作是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要技術(shù)[7～9]， 常見的免標(biāo)記分離方法有磁學(xué)[10，11]、光學(xué)[12]，流體力學(xué)[13]、聲學(xué)[14]以及電動(dòng)學(xué)技術(shù)[15]?等。在這些技術(shù)中，電動(dòng)學(xué)是最有前景的方法之一，它根據(jù)電學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面積等的差異，從普通細(xì)胞中操縱特定細(xì)胞[8，16，17]。電動(dòng)學(xué)分離技術(shù)適用于由完全不同的細(xì)胞所組成的混合物的細(xì)胞操作（如癌細(xì)胞和血細(xì)胞）。然而，對(duì)外部形態(tài)相同，而內(nèi)部組蛋白不同的細(xì)胞分離仍存在一些困難。

針對(duì)以上問題，研究者開發(fā)出了一種面向細(xì)胞免標(biāo)記檢測(cè)與分離的多電極陣列微流控芯片，該芯片可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞空間內(nèi)的高速分離[18～20]。由于多電極陣列的存在，通過選擇激勵(lì)電極的不同組合，可以控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向和電動(dòng)力的強(qiáng)度。在介電泳力（Dielectrophoretic force， DEP）、熱浮力和電熱力等交流電動(dòng)力中，介電泳力作用于不同細(xì)胞，產(chǎn)生不同方向的運(yùn)動(dòng)，而其它力則作用于流體，產(chǎn)生渦流運(yùn)動(dòng)，以推動(dòng)細(xì)胞向電極方向靠近[21]。目前，將多電極陣列微流控芯片應(yīng)用于由外部形態(tài)相同，但細(xì)胞內(nèi)組蛋白不同的兩種細(xì)胞的高速分離，尚未得到充分研究。

本研究采用已開發(fā)的多電極陣列微流控芯片，首先通過數(shù)值計(jì)算，得到了最優(yōu)電極組合方式，以得到均勻的電場(chǎng)分布與最大的介電泳力。針對(duì)人肺成纖維細(xì)胞 （Medical research council cell strain 5，MRC-5），采用帶負(fù)電荷的綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）和帶正電的組蛋白（Histone，HT）改變細(xì)胞內(nèi)部的成分，研究了綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的組蛋白-GFP細(xì)胞（GFP-HT）與野生型細(xì)胞（Wild type， WT）的不同運(yùn)動(dòng)。最后，通過實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)WT和GFP-HT兩種細(xì)胞進(jìn)行了分離。本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細(xì)胞的方法， 為高通量分離細(xì)胞提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

2??實(shí)驗(yàn)方法

2.1?儀器與試劑

Eclipse LV 100顯微鏡（日本Nikon公司），配備有50倍物鏡（NA=0.55）、Fastcam SA3高速相機(jī)（日本Photron公司）。

人成纖維細(xì)胞來源的MRC-5 SV1 TG1細(xì)胞系（日本RIKEN BioResource Research Center ）; 10%胎牛血清（日本Nacalai Tesque公司）; 青霉素、鏈霉素、低葡萄糖Dulbecco改良伊格爾液（美國(guó)GIBCO公司）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?微流控芯片加工?多電極陣列微流控芯片的制作過程如下：（1）利用光刻法在石英平板上沉積5片10 μm的電極，電極之間間隔為200 μm; （2）在沉積好的電極上再鋪一片石英平板，構(gòu)成一個(gè)電極夾層; （3）在鋪好的第二層石英平板上繼續(xù)利用光刻法沉積第二層的5個(gè)電極; （4）重復(fù)之前的方法，共沉積4層電極; （5）在石英與電極夾層的結(jié)構(gòu)上開出方形槽，作為流道，即可在流道周圍形成5個(gè)橫截面電極。加工方法步驟與文獻(xiàn)[18]類似，但文獻(xiàn)[18]采用菱形結(jié)構(gòu)的微流道，而本研究的微流道是方形結(jié)構(gòu)。

2.2.2?樣品制備?制備通過轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白融合組蛋白修飾的MRC-5人肺成纖維細(xì)胞系，以觀察WT細(xì)胞系和GFP-HT細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)電荷變化的效果。GFP-HT質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染程序參照文獻(xiàn)[22]方法。將穩(wěn)定表達(dá)GFP融合組蛋白的MRC-5細(xì)胞（GFP-HT細(xì)胞）和野生型MRC-5細(xì)胞（WT細(xì)胞）培養(yǎng)在有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素（分別為50 u/mL和50 μg/mL）的低葡萄糖Dulbecco改良伊格爾液中。在多電極陣列微流控芯片分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸于Dulbecco磷酸鹽緩沖液（D-PBS）中，調(diào)整最終密度為1.0 × 106 cell/mL。

2.2.3?實(shí)驗(yàn)過程?為了避免細(xì)胞電致穿孔現(xiàn)象，采用了交流電壓輸入，電壓Vpp=20 V，頻率f=10 MHz。 交流電顯著降低了細(xì)胞膜內(nèi)外的電勢(shì)差，因而避免了細(xì)胞電致穿孔現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)中，在多層電極微流控裝置的主流通道中填充細(xì)胞懸浮液后，將AC電壓施加到第一和第三層電極，而第二和第四層電極被設(shè)定為接地。用顯微鏡觀察由于施加電壓引起的細(xì)胞顆粒運(yùn)動(dòng)。焦平面被設(shè)置為電極的第一層，在施加交流電壓后，以60 fps捕獲圖像。

采用粒子跟蹤測(cè)速（PTV）技術(shù)，通過拉格朗日方法在x-z平面跟蹤流體中的單個(gè)細(xì)胞。x-z平面平行于電極層， x方向垂直于電極，朝向多層電極微流控裝置主流通道的中心區(qū)域?？紤]時(shí)間變化，計(jì)算細(xì)胞的速度，比較3種細(xì)胞之間的細(xì)胞顆粒運(yùn)動(dòng)。在對(duì)電極施加交流電壓的狀態(tài)下，以0.1 s的時(shí)間間隔依次追蹤距離電極（25 ± 5） μm的中心線（z=0）附近的細(xì)胞，使用內(nèi)部開發(fā)的圖像分析程序計(jì)算細(xì)胞的軌跡。

2.3?多電極電場(chǎng)分布計(jì)算

本研究討論的交流電場(chǎng)控制方程是麥克斯韋方程組。在電場(chǎng)是角頻率為ω時(shí)間諧波，并且沒有相位滯后的情況下，可以使用電場(chǎng)的復(fù)數(shù)表示法=E0exp（jωt），其中電場(chǎng)的相量幅度E0是實(shí)數(shù)。對(duì)于微電極結(jié)構(gòu)，磁效應(yīng)可以忽略不計(jì)[20]。因此，復(fù)雜形式的麥克斯韋方程簡(jiǎn)化為：

其中，σ和ε是流體的電導(dǎo)率和介電常數(shù)， ρe是局部電荷密度，u是流體速度。式（1）表明，可采用復(fù)合電勢(shì)描述復(fù)合電場(chǎng)，即：

其中，0是電勢(shì)的相位幅度。式（2）中的對(duì)流項(xiàng)ρeu是可以忽略的，因?yàn)樵诖藯l件下電雷諾數(shù)估計(jì)為Reel=U/（σD）～10111[14]。此外，假設(shè)電導(dǎo)率和介電常數(shù)的空間變化很小，通過應(yīng)用小擾動(dòng)理論[4]，式（2）和式（3）減小到拉普拉斯方程的電勢(shì)，20=0。為了方便描述電動(dòng)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間平均效應(yīng)，本研究采用復(fù)合場(chǎng)相量幅度的均方根（RMS）場(chǎng)。相應(yīng)地，拉普拉斯方程=02求解，之后，靜電場(chǎng)E=Ε0/2的RMS由式（4）計(jì)算：

多電極電壓施加方式分類，其中數(shù)字①②③④代表微流道單側(cè)電極序號(hào)。單側(cè)4個(gè)電極施加電壓方式分為4類（A、B、C和D）：A（10××）、B（1000）、C（1001）、D（1010）。以A（10××）為例，其含義為，第一個(gè)電極加電壓（用1表示），第二個(gè)電極接地（用0表示），第三、四個(gè)電極空置不使用（用×表示），具體分類見表1。

2.4?正負(fù)介電泳（DEP）

為了分離兩種細(xì)胞，需要得到不同方向的DEP力。分析產(chǎn)生DEP力的公式，在交流電作用下，介電泳（DEP）力可表示為：

其中，dc是細(xì)胞直徑， εf是溶液介電常數(shù)，ω是外加電場(chǎng)的角頻率，Erms是電場(chǎng)強(qiáng)度的均方根。 Re[CM（ω）]是方程（5）中復(fù)數(shù)CM（ω）的實(shí)部。

實(shí)際材料的介電常數(shù)和電導(dǎo)率僅是在特定頻率下材料的“常數(shù)”，并反映了在該頻率下極化與場(chǎng)強(qiáng)關(guān)系的斜率。通常，介電常數(shù)和電導(dǎo)率是頻率的單調(diào)變化函數(shù)。懸浮體和周圍介質(zhì)之間這些變化的相互作用引起介質(zhì)中物體的凈極化，介質(zhì)在頻率范圍內(nèi)可能具有相當(dāng)復(fù)雜的形狀。

其中，εc 和εf是細(xì)胞和流體的復(fù)介電常數(shù)。式（6）在一定頻率范圍內(nèi)具有正值和負(fù)值，就產(chǎn)生了正、負(fù)介電泳，即DEP力對(duì)于 Re[CM（ω）]的正值是正的，對(duì)于Re[CM（ω）]的負(fù)值是負(fù)的。

單個(gè)細(xì)胞在流體中運(yùn)動(dòng)受力為：

其中， mc為細(xì)胞的質(zhì)量，uc為細(xì)胞的速度，F(xiàn)D為細(xì)胞受到流體的曳力，其表達(dá)式為：

3?結(jié)果與討論

3.1?兩類細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在細(xì)胞和分子生物學(xué)中，蛋白質(zhì)印跡法是用于鑒定蛋白質(zhì)的重要技術(shù)[23]。根據(jù)顯微鏡觀察和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分的鑒定[18]，建立了GFP-HT和WT兩種細(xì)胞的示意圖。兩類細(xì)胞在相襯圖像和熒光圖像中的觀察結(jié)果如圖3右方所示。相襯圖像表示了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，熒光圖像顯示了細(xì)胞中GFP的量。從熒光圖像中可以看出，GFP-HT細(xì)胞顯示斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)， 表明對(duì)于GFP-HT細(xì)胞，GFP僅出現(xiàn)在細(xì)胞核中。在本研究中，蛋白質(zhì)印跡法確定了兩種細(xì)胞中的蛋白質(zhì)類型與含量，各種蛋白質(zhì)成分含量影響兩種不同細(xì)胞的電氣參數(shù)，對(duì)細(xì)胞分離起到了關(guān)鍵作用[22]。此細(xì)胞示意圖為實(shí)驗(yàn)研究中分析細(xì)胞介電泳運(yùn)動(dòng)提供了基礎(chǔ)。

3.2?細(xì)胞懸浮液的電學(xué)性質(zhì)

細(xì)胞懸浮液的電學(xué)參數(shù)決定了介電泳力的正負(fù)值，本研究考察了不同細(xì)胞懸浮液的電學(xué)參數(shù)特點(diǎn)。在f=0～5 MHz時(shí)，對(duì)比WT、GFP-HT和蔗糖（Sucrose）3種溶液的相對(duì)介電常數(shù)。隨著頻率增大，相對(duì)介電常數(shù)都下降，這是因?yàn)殡娙莩煞衷诟哳l下逐漸被導(dǎo)通。由于細(xì)胞的導(dǎo)電性比蔗糖大，蔗糖的相對(duì)介電常數(shù)值明顯低于兩種細(xì)胞懸浮液。3種溶液的相對(duì)介電常數(shù)在不同頻率下都存在差別，可以產(chǎn)生不同的介電泳力，不同介電參數(shù)的細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)分離。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離所需的確切頻率值，以及產(chǎn)生更大介電泳力的多電極如何組合，需要通過仿真與實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。

3.3?多電極電場(chǎng)的計(jì)算

本研究采用多電極微流控芯片實(shí)現(xiàn)高速細(xì)胞分離，施加電流時(shí)，不同的電極組合方式會(huì)產(chǎn)生不同的電場(chǎng)分布，進(jìn)而影響細(xì)胞分離效果。因此，本研究采用數(shù)值計(jì)算尋找最佳的電極組合方式。

多電極陣列微流控芯片一個(gè)橫截面內(nèi)不同電極組合的電場(chǎng)分布數(shù)值計(jì)算結(jié)果。其中，組合方式B（1000）、C（1001）和D（1010）得到了y方向上較均勻的電場(chǎng)，容易在x方向得到均勻分布的DEP力; 組合方式A（10××）的電場(chǎng)強(qiáng)度主要集中在右上方，無法在整個(gè)橫截面上施加DEP力。定量對(duì)比了電場(chǎng)強(qiáng)度的大小與分布均勻性， ?組合方式D（1010）中，第1和3根電極施加電流，2和4電極接地， 能夠在y方向上得到相對(duì)均勻的電場(chǎng)強(qiáng)度平方的梯度。由式（5）得知，電場(chǎng)強(qiáng)度平方的梯度與DEP力成正比。根據(jù)式（5），此組合方式也可在y方向上產(chǎn)生較大且均勻的DEP力。故選擇組合方式D（1010）為最佳電極組合方式，進(jìn)行細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)分析。

3.4?不同細(xì)胞運(yùn)動(dòng)對(duì)比分析?按照組合方式D（1010）施加電場(chǎng)后，在不同頻率下分析了野生型（WT）細(xì)胞和組蛋白-GFP（GFP-HT）型細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)方向與速度。對(duì)于兩種細(xì)胞，在施加頻率為f=10 kHz時(shí)，運(yùn)動(dòng)方向均為遠(yuǎn)離電極的方向，表明在此頻率下，兩種細(xì)胞均受到負(fù)DEP力; 在施加頻率為f ≥ 100 kHz時(shí)，運(yùn)動(dòng)方向均為靠近電極的方向，表明兩種細(xì)胞受到了正DEP力。顏色也表明，越靠近電極，運(yùn)動(dòng)速度越大。

能夠同時(shí)對(duì)兩類細(xì)胞產(chǎn)生正與負(fù)的DEP力的頻率被稱為分離頻率。為了更加定量化確定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向與分離頻率的關(guān)系，對(duì)細(xì)胞在不同頻率下的Re[CM（ω）]進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析。對(duì)于WT細(xì)胞，在頻率為f=25 kHz時(shí)，Re[CM（ω）]=0，說明f=25 kHz是WT細(xì)胞產(chǎn)生正負(fù)DEP力的分界點(diǎn); 對(duì)于GFP-HT細(xì)胞，f=35 kHz時(shí)，Re[CM（ω）]=0，說明f=35 kHz是GFP-HT產(chǎn)生正與負(fù)的DEP力的分界點(diǎn)。

負(fù)的Re[CM（ω）]產(chǎn)生負(fù)DEP力，細(xì)胞遠(yuǎn)離電極運(yùn)動(dòng); 同樣地，正的Re[CM（ω）]產(chǎn)生正DEP力，細(xì)胞靠近電極運(yùn)動(dòng)。因此基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以取f=30 kHz為兩種細(xì)胞的分離頻率。

從等效電路的觀點(diǎn)來看，對(duì)于一個(gè)單細(xì)胞，細(xì)胞膜具有電容成分，可等價(jià)為電容器，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核可等價(jià)為電阻。對(duì)于兩種類型的細(xì)胞，不同的運(yùn)動(dòng)最初來自細(xì)胞內(nèi)成分中的蛋白質(zhì)量。具有較小介電常數(shù)的組蛋白GFP型細(xì)胞在電場(chǎng)作用下表現(xiàn)出較低的極化效應(yīng)，產(chǎn)生不同的Re[CM（ω）]，并對(duì)應(yīng)不同方向的DEP力。

3.5?細(xì)胞分離應(yīng)用

利用以上分析結(jié)果，對(duì)多電極陣列微流控芯片5個(gè)橫截面的單側(cè)電極都采用D（1010）類型的電流施加方式，施加f=30 kHz的電流，對(duì)兩種細(xì)胞WT和GFP-HT進(jìn)行了分離實(shí)驗(yàn)。在傳統(tǒng)的微流體裝置中，流體動(dòng)力聚焦是通過多個(gè)泵和/或壓力源仔細(xì)控制流速實(shí)現(xiàn)的。本研究中的分離實(shí)驗(yàn)采用的微流控芯片有3個(gè)入口，采用位于兩邊的2個(gè)入口可以使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)形成鞘流（Sheath flow），從而縮小了細(xì)胞懸浮液流動(dòng)的區(qū)域，使細(xì)胞懸浮液聚焦于一側(cè)電極界面附近，并大大減小了擴(kuò)散距離。

入口A通入蔗糖溶液，入口B通入WT與GFP-HT兩種細(xì)胞混合液。調(diào)整入口A和B的流量，可以調(diào)整細(xì)胞混合液的在微流道內(nèi)的濃度。通過檢測(cè)出口A和B中兩種細(xì)胞的濃度，可以得到細(xì)胞分離率。結(jié)果表明，增大入口A的入口流量，可以顯著提高分離率。當(dāng)入口A與B的流量比為12∶1時(shí)，細(xì)胞分離率可達(dá)到93.5% （表2）。當(dāng)細(xì)胞濃度過大時(shí)，細(xì)胞間的干涉強(qiáng)烈，不利于WT和GFP-HT兩種細(xì)胞的分離。

4?結(jié) 論

利用多電極陣列微流控芯片的特殊結(jié)構(gòu)，在不同頻率、多電極復(fù)雜電場(chǎng)下，研究了外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白成分不同的人肺部成纖維細(xì)胞MRC-5的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)。通過對(duì)一個(gè)橫截面的電極陣列進(jìn)行數(shù)值計(jì)算，可以發(fā)現(xiàn)，橫截面內(nèi)單側(cè)4個(gè)電極交替施加電流時(shí)，可以得到均勻的電場(chǎng)分布與最大的介電泳力。進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)對(duì)MRC-5野生型（WT）與組蛋白-GFP型（GFP-HT）細(xì)胞進(jìn)行了介電泳力的頻譜分析，發(fā)現(xiàn)在多電極電場(chǎng)下兩種細(xì)胞的分離頻率為f=30 kHz。細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較小的細(xì)胞混合液可以得到較大的分離率， 即當(dāng)入口A與B的流量比為12∶1時(shí)，細(xì)胞的分離率可以達(dá)到93.5%。 本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細(xì)胞的方法為細(xì)胞的高流量分離提供了研究基礎(chǔ)。

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