于慧娟 郭夏麗

（鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，鄭州 450000）

據(jù)報道我國的秸稈年產(chǎn)量位居世界第一。秸稈中含有豐富的有機質(zhì)及氮、磷、鉀、鎂、鈣和硫等農(nóng)作物生長必需的營養(yǎng)元素，充分發(fā)揮和利用秸稈還田的積極效應(yīng)，對促進農(nóng)作物生長和養(yǎng)分資源的高效利用具有重要意義。有研究表明，長期秸稈還田，能增加土壤有機質(zhì)，改善土壤理化性狀。并且可以減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的污染，實現(xiàn)秸稈資源化利用［1-3］。小麥成熟后，其秸稈中纖維素含量明顯增高，可高達51.16%［4］，經(jīng)處理后在農(nóng)業(yè)方面可用做肥料、飼料、生活燃料及食用菌基料等。如何加速秸稈纖維素的降解是提高秸稈在農(nóng)業(yè)方面利用率的關(guān)鍵。

纖維素酶在秸稈降解過程中起著至關(guān)重要的作用。1906年，Seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶，可以分解天然纖維素［5］，人們相繼開展了利用微生物對作物秸稈進行降解的研究。自然界中存在大量能夠產(chǎn)生纖維素酶的真菌和細(xì)菌，20世紀(jì)40年代以來，眾多研究者已篩選出大量纖維素降解菌，主要包括木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、漆斑霉屬（Myrothecium），毛殼霉屬（Chaetomium）等，為篩選秸稈降解菌提供了重要參考依據(jù)［6-10］。利用這些微生物處理纖維素具有纖維素分解效率高、無污染的特點，這類微生物資源經(jīng)分離篩選和馴化后一般對人畜無害、可提高生物轉(zhuǎn)化效率并且作用條件溫和。本實驗主要從森林中的腐殖土、小草的根際土壤還有食用桑葉的蠶蛹糞便中進行篩選。

眾多研究者在篩選纖維素降解菌時多采用剛果紅染色法，但剛果紅染色法會造成菌落之間混雜以及假陽性等現(xiàn)象，故本實驗在篩選菌株時首先采用秸稈粉篩選培養(yǎng)基進行篩選，以秸稈粉作為唯一碳源考察菌株的生長情況，后用剛果紅染色法進行進一步篩選，以期更直接快速地篩選出理想菌株。將篩選得到的菌株液體培養(yǎng)，測定小麥秸稈降解率以及纖維素酶活，探究菌株的纖維素酶活與秸稈降解之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種篩選樣品來源 菜田土、小草根際土、蠶糞及森林土。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）赫奇遜氏（Huchinson）無機鹽培 養(yǎng) 液 ：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，蒸餾水1 000 mL。（2）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g，瓊脂20 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液1 000 mL。（3）秸稈粉平板培養(yǎng)基：小麥秸稈80℃烘干至恒重，粉碎過100目篩。小麥秸稈粉10 g，瓊脂粉20 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液1 000 mL。（4）濾紙平板培養(yǎng)基：赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液中添加瓊脂粉20 g/L，待菌種轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基后，立刻鋪一片無菌扇形濾紙片在培養(yǎng)基上。（5）液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：小麥秸稈粉20 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液1 000 mL。（6）秸稈降解培養(yǎng)基：小麥秸稈烘干剪成1 cm左右的段狀，段狀秸稈20 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液1 000 mL。（7）生物量測定培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化 稱取10 g樣品接入90 mL無菌水中，恒溫震蕩箱（28℃、120 r/min）中震蕩30 min，取樣品懸液，用無菌水稀釋成 10-1、10-2、10-3的濃度梯度，吸取稀釋濃度為10-3的稀釋液，涂布于秸稈粉平板培養(yǎng)基中［11］，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，根據(jù)在以秸稈粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中菌落的直徑（即生長速度）來評估菌株對秸稈的降解利用情況，選取直徑較大的菌株進行分離純化并保存。將純化好的菌株分別點種在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4 d，用1 g/L 剛果紅染液染色20 min，棄去染液，加入1 mol/L NaCl溶液，洗滌20 min 后測量菌落直徑和透明圈直徑，分別用D和 H來表示。根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑比值大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株進行下一步研究［12-14］。

1.2.2 秸稈降解 將純化保存的菌株分別轉(zhuǎn)接至平板，培養(yǎng)5 d后，用無菌水制成菌懸液，分別取5 mL菌懸液接種于每瓶秸稈降解培養(yǎng)基中，置于恒溫（28℃、120 r/min）震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 d后將秸稈取出，用蒸餾水沖洗，再用稀酸溶液沖洗，以去除其上附著的菌體和CaCO3沉淀等，再用蒸餾水沖洗3次，80℃烘干至恒重，以失重法計算秸稈降解率。

W0：初始秸稈干重；Wt：培養(yǎng)t時間后秸稈干重。

1.2.3 濾紙腐解 將菌株轉(zhuǎn)接至赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)基后，把滅菌后的扇形濾紙平鋪至平板中。28℃下培養(yǎng)7 d，觀察濾紙的腐爛程度。

1.2.4 纖維素酶活的測定 纖維素粗酶液的制備：制備每株菌株的菌懸液（方法同1.2.2），接5 mL菌懸液入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，置于恒溫震蕩（28℃、120 r/min）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于1、2、3、5、6、9、12和15 d取培養(yǎng)液過濾，濾液即為制備的粗酶液。

內(nèi)切酶活（endo-1，4-β-D-glucanase，EG/Cen）的測定：取4支帶有刻度的試管，編號后分別加入1.5 mL的0.5% CMC-Na溶 液（0.5 g CMC-Na定容到100 mL 0.05 mol/L，pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中）作反應(yīng)底物并提供緩沖環(huán)境，0.5 mL粗酶液，其中1號試管中加入2 mL DNS以鈍化酶活性，作空白對照。4支試管同時放入水浴鍋中50℃保溫30 min。保溫反應(yīng)后，立刻取出，并向2、3、4號試管中加入2 mL DNS以終止反應(yīng)，搖勻后沸水浴10 min，之后冷卻至室溫并用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。以1號試管的溶液為空白對照調(diào)零點，在540 nm波長下測定2、3、4號試管溶液的吸光值［15］。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參見農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T9122004［16］，根據(jù)每次測定的葡萄糖量，計算出相應(yīng)的酶活力。

外切酶活（exo-1，4-β-D-glucanase，CBH/Cex）的測定：用50 mg脫脂棉作為反應(yīng)底物，加入1.5 mL的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.05 mol/L，pH4.8），代替內(nèi)切酶活測定過程中CMC-Na溶液，其余操作一致。

β-葡萄糖苷酶活（β-1，4-glucosidase，β-Gase）的測定：用1.5 mL 1%的水楊苷溶液作為反應(yīng)底物代替內(nèi)切酶活測定過程中CMC-Na溶液，其余操作一致。

酶活單位（U/mL）定義為：50℃下，每毫升酶液在上述反應(yīng)條件下1 min內(nèi)催化底物水解生成 1 μmol 葡萄糖所需的酶量。

纖維素酶活力（U/mL）=（m×1000×n）/（M×V×t）。m：反應(yīng)過程中產(chǎn)生葡萄糖的量（mg）；n：粗酶液稀釋倍數(shù)；M：葡萄糖分子質(zhì)量（μg /μmol）；V：反應(yīng)體系中粗酶液的體積（mL）；t：反應(yīng)時間（min）。

1.2.5 生物量的測定 根據(jù)干重法測定不同菌株的生物量。

2 結(jié)果

2.1 菌種的篩選

2.1.1 菌種的初篩 挑選可以在以秸稈粉為唯一碳源的秸稈粉培養(yǎng)基長勢較好和H/D較大的菌株。在秸稈粉平板中篩選得到5株菌株，編號為z-5、4-1、3-1、2-2、m-2。其中z-5菌落直徑最大，在剛果紅染色實驗的結(jié)果中，菌株z-5的H/D位居第二，達到16.2 mm，透明圈比較明顯，具有較大的研究潛力（表1）。

表1 不同菌株的H/D

2.1.2 小麥秸稈降解率的測定 本實驗篩菌的主要目的是篩選秸稈降解菌，故對菌株的秸稈降解率進行考察。將5株真菌分別接入秸稈降解培養(yǎng)基中，置于28℃，120 r/min下震蕩培養(yǎng)10 d，測得小麥秸稈降解率如圖1所示。

綠色木霉是目前已知的纖維素酶活較高的菌株，常被應(yīng)用于農(nóng)作物秸稈的降解中，因此以綠色木霉為參考菌株。由圖1可知，5株真菌的秸稈降解率均高于綠色木霉。其中菌株z-5和菌株4-1的降解率最高，分別為47%和45%，其次是菌株3-1、菌株2-2和菌株m-2，分別為32%、31%和29%。在相同的秸稈降解條件下，綠色木霉的小麥秸稈降解率最低，為20%左右，菌株z-5的降解率是綠色木霉的2倍以上。

圖1 不同菌株的小麥秸稈降解率

2.2 不同菌株的濾紙腐解情況

將秸稈降解率高于30%的4株菌株分別涂布轉(zhuǎn)接至濾紙培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，結(jié)果如表2所示。其中菌株z-5和菌株4-1對濾紙的降解能力最強；菌株3-1和菌株2-2次之，實驗結(jié)果與小麥秸稈降解率實驗的結(jié)果相似。

表2 不同菌種對濾紙的降解能力

2.3 不同菌種纖維素酶活的測定

將4株真菌進行液態(tài)培養(yǎng)，分別測定它們在不同時期的外切葡聚糖酶活，內(nèi)切葡聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活。

在整個培養(yǎng)過程中，菌株4-1、2-2和z-5的內(nèi)切葡聚糖酶活均呈現(xiàn)先增后降的趨勢，而菌株3-1的內(nèi)切葡聚糖酶活呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢（圖3）。菌株4-1和z-5的內(nèi)切酶活在第3 天達到最大，分別為56 U/mL和49 U/mL；而菌株2-2內(nèi)切酶活在第5天達到最大值，為76 U/mL。菌株3-1的內(nèi)切酶活在第15天時達到14.62 U/mL。

圖3 不同菌株的內(nèi)切葡聚糖酶活

菌株4-1、菌株2-2和菌株z-5的外切葡聚糖酶活變化趨勢與它們的內(nèi)切葡聚糖酶活變化趨勢相似，即先增后降（圖4）。在第3天時3個菌株的外切酶活均達到最大，分別為43 U/mL、58 U/mL和54 U/mL。第3-9天，菌株z-5與菌株2-2的外切酶活值接近。第9天至第15天，菌株z-5的外切酶活均大于菌株2-2。菌株3-1外切酶活在整個培養(yǎng)期中一直呈增長趨勢，在第15天達到10 U/mL。

圖4 不同菌株的外切葡聚糖酶活

菌株4-1、菌株z-5和菌株2-2的β-葡萄糖苷酶活變化與它們的內(nèi)、外切葡聚糖酶活變化趨勢相似，即先增后降（圖5）。菌株z-5和菌株4-1的酶活在第3天達到最大，分別為47 U/mL和59 U/mL，菌株2-2在第5天達到最大，為76 U/mL，其中菌株2-2的酶活峰值最大。在第9天，3個菌株的酶活值接近。在第9-12天，菌株z-5酶活下降不明顯，而菌株2-2和4-1均有明顯下降，其中菌株2-2下降幅度最大。菌株3-1的β-葡萄糖苷酶活隨著培養(yǎng)時間延長不斷增加，第9天后增加幅度加大，第15天達到了60 U/mL。

圖5 不同菌株的β-葡萄糖苷酶活

2.4 不同菌株生物量的比較

比較4個菌株的生物量發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)10 d時菌株z-5的生物量最大，其次是菌株3-1和菌株4-1，菌株2-2的生物量最小，表明菌株z-5生長速率最大，菌株2-2生長速率最?。ū?）。菌株2-2的內(nèi)切酶活與外切酶活峰值均是菌株3-1相應(yīng)酶活峰值的5倍以上，但兩者的秸稈降解能力相似。在相同的培養(yǎng)條件下，菌株2-2的生物量僅為菌株3-1的約1/4，兩者生物量差異顯著（P＜0.05）。由此推測較低的生物量可能是造成菌株2-2秸稈降解率偏低的因素之一。

表3 不同菌株的生物量

3 討論

秸稈的主要成分是纖維素，纖維素是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵結(jié)合形成的高分子化合物，包括葡萄糖單位2 000-10 000個，濾紙是聚合度中等的纖維素材料。本實驗中所篩選菌株的濾紙腐解結(jié)果與它們的秸稈降解結(jié)果相似，即菌株z-5和菌株4-1降解能力較高，而菌株3-1和菌株2-2較低。同時，通過對木質(zhì)素降解酶系即木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶等酶活的測定，未發(fā)現(xiàn)這些菌株具有木質(zhì)素降解酶活（數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)），表明本實驗所篩選的秸稈降解菌具有降解秸稈纖維素的能力，但不具有降解秸稈木質(zhì)素的能力。同時說明濾紙的腐爛程度能較好地反映出菌株的纖維素降解能力。

外切葡聚糖酶作用于纖維素鏈的末端，產(chǎn)生纖維二糖。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，水解纖維素分子內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子打斷，為外切葡聚糖酶提供更多的還原端或非還原端。β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。該3種酶的合理搭配能夠有效分解纖維素為葡萄糖。在纖維素酶活的檢測中發(fā)現(xiàn)，所篩選菌株均具有3種纖維素降解酶，纖維素酶種類較為齊全，但它們的纖維素酶活的變化趨勢卻不完全相同，其中菌株3-1的3種纖維素降解酶活在實驗過程中逐漸加大，其他3株菌的3種纖維素酶活均為先增后降。菌株z-5和菌株4-1的3種酶活峰值均出現(xiàn)在同一天，而菌株2-2的3種酶活峰值出現(xiàn)在不同時間內(nèi)。菌株2-2的3種纖維素酶活的峰值均為最高，但秸稈降解率卻不是最高，這與王洪媛和范丙全［17-18］研究結(jié)果不同。推測原因有二：其一，菌株2-2的內(nèi)切酶活和β-葡萄糖苷酶活峰值均出現(xiàn)在第5天，外切酶活峰值則出現(xiàn)在第3天，3種酶的協(xié)同性較低。其二，菌絲的匍匐生長可破壞秸稈的致密結(jié)構(gòu)，菌株2-2的生長速率較低，導(dǎo)致破壞秸稈結(jié)構(gòu)作用減弱，因此秸稈降解率最低。菌株z-5的3種酶的協(xié)同性較高，而且生長速率快，菌絲的蔓延對秸稈結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生一定破壞作用，促進相應(yīng)酶與底物接觸，由此秸稈降解率最高。雖然菌株4-1的生長速率低于菌株3-1，但在秸稈降解的10 d內(nèi)，菌株4-1的3種酶活均高于菌株3-1，由此菌株4-1的秸稈降解率高于菌株3-1，表明纖維素酶的作用在秸稈降解中起著主導(dǎo)作用。

4 結(jié)論

從土樣中分離純化出4株高效秸稈降解菌，經(jīng)初步鑒定4株菌株皆為真菌，測定所得菌株的纖維素酶活、濾紙腐爛情況和小麥秸稈降解率。其中秸稈降解效果最好的為菌株z-5，10 d內(nèi)秸稈降解率可達47%，并且菌株z-5酶系種類齊全，濾紙腐解試驗與小麥秸稈降解實驗結(jié)果相似。