李苗苗，古麗君，馬碧花，王美寧，藺偉虎，許文博，曠 宇，田 沛

(蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

自然界中大多數(shù)陸生植物都可與微生物形成互利共生或內(nèi)寄生關(guān)系，禾草內(nèi)生真菌是廣為關(guān)注和研究的內(nèi)生真菌之一[1-3]。禾草內(nèi)生真菌是指在禾草體內(nèi)度過全部或大部分生活周期,而宿主不顯示任何外部癥狀的一大類真菌[4-5]。目前，對禾草內(nèi)生真菌的研究主要集中在廣泛分布于冷季型禾草中的香柱菌(Epichloё)屬及其無性態(tài)Neotyphodium屬，內(nèi)生真菌因具有提高群落競爭性、增強(qiáng)宿主抗逆性等優(yōu)點(diǎn)而受到越來越多的關(guān)注。禾草和內(nèi)生真菌之間存在互惠共生關(guān)系，主要表現(xiàn)在禾草能夠?yàn)閮?nèi)生真菌的生長提供碳源和礦物質(zhì)，而內(nèi)生真菌不僅能夠促進(jìn)禾草的生長，提高對不良環(huán)境的抵抗能力、還能減少食草動(dòng)物采食等，從而提高宿主生態(tài)適應(yīng)性，增強(qiáng)種群競爭力[6-7]。禾草內(nèi)生真菌共生體的研究包括內(nèi)生真菌對宿主生長的影響[8-11]；對鹽脅迫、干旱、病蟲害、重金屬等逆境下宿主抗逆性的影響[12-18]；對禾草內(nèi)生真菌的分離鑒定及對毒性的改良[19-20]；以及對共生體進(jìn)化過程和途徑的探索等方面[21]。

多年生黑麥草(Loliumperenne)為禾本科(Poaceae)黑麥草屬多年生疏叢型草本植物，是世界范圍內(nèi)一種重要的冷季型草坪草[22]，生長快、分蘗多、繁殖力強(qiáng)、品質(zhì)好、再生性強(qiáng)、質(zhì)地柔軟、株型外觀優(yōu)美，是草坪建植的良好品種。它原產(chǎn)北非、西南歐和亞洲西南的溫帶地區(qū)，現(xiàn)廣泛分布于各溫帶地區(qū)[23]。

化感作用(Allelopathy)是指植物通過向自身所處的外界環(huán)境中釋放某些化學(xué)物質(zhì)(化感物質(zhì))進(jìn)而對周圍環(huán)境中的其他植物或微生物產(chǎn)生有利或不利影響，從而使植物在生長競爭中處于有利地位，獲得生長優(yōu)勢。目前，有關(guān)內(nèi)生真菌化感作用的研究報(bào)道，主要集中于多年生黑麥草[24-26]和高羊茅(Festucaarundinacea)[27-28]，研究表明內(nèi)生真菌的浸染可以提高宿主植物的化感作用。中華羊茅(Festucasinensis)的葉較纖細(xì)，莖部為紫色，根為須根。其分蘗能力強(qiáng)，葉量豐富且枯黃時(shí)間晚，產(chǎn)量較為穩(wěn)定，有較強(qiáng)的適應(yīng)性。但中華羊茅單播時(shí)，常因雜草叢生而影響其產(chǎn)量，因此，多與其他牧草伴生時(shí)產(chǎn)量更佳。為探究其化感作用，以未浸染內(nèi)生真菌的多年生黑麥草為材料，研究中華羊茅帶菌(E+)和不帶菌(E-)草粉對多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響，為同一生境內(nèi)生真菌共生體與黑麥草的生長提供理論依據(jù)，以期為中華羊茅內(nèi)生真菌的開發(fā)和利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2017年8月在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗(yàn)地采集已生長3年的6個(gè)不同地理種群的中華羊茅被內(nèi)生真菌侵染的(E+)與未侵染的(E-)植株地上部分(離地面1 cm收集樣品)，用剪刀將離地面1 cm整株植物剪下后分別置于15 mL離心管中，放于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)冷凍干燥機(jī)低溫干燥48 h/-80℃(Labconco FreeZone Plus 6 L，LBC#7934030，美國)，后用組織研磨儀研磨(RETSCH MM400，25frqucey/1 min)，過2 mm篩，將研磨后的草粉裝入3號(hào)自封袋中，4℃保存?zhèn)溆?表1)。

1.2 供試種子

兩種不同品種的多年生黑麥草種子Venus和Esquire，購于百綠公司。經(jīng)苯胺藍(lán)檢測法[8]，對種子進(jìn)行內(nèi)生真菌檢測，檢測結(jié)果為均不帶內(nèi)生真菌。

1.3 試驗(yàn)方法

滅菌的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中分別加入E+和E-中華羊茅草粉1 g[24]，搖勻后蓋上2層滅菌的濾紙，加入10 mL蒸餾水，浸泡24 h。分別選取大小均勻，飽滿的多年生黑麥草種子用5%次氯酸鈉消毒5 min，再用無菌水沖洗3次，繼續(xù)用75%酒精消毒3 min，再用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙將種子表面的水分吸干后均勻的擺放于含有滅菌濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿放置50粒種子，以不加中華羊茅草粉，只放滅菌濾紙為對照。用封口膜(4″×125FT/Roll)密封，試驗(yàn)共設(shè)置26個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于人工變溫光照培養(yǎng)箱(溫度25℃/15℃日/夜；光周期為16 h/8 h光/暗;光照度5 000 lx)，胚根長度超過2 mm視為發(fā)芽，每天記錄發(fā)芽的種子數(shù)，第5 d進(jìn)行種子發(fā)芽勢的測定，12 d后計(jì)算最終發(fā)芽率。21 d后每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取10株幼苗，測定其鮮重、干重、胚根長和胚芽長，并計(jì)算發(fā)芽率、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、胚根胚芽比、幼苗含水量。指標(biāo)計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行。

表1 不同地理種群中華羊茅

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010錄入并作圖。各指標(biāo)用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華羊茅草粉對多年生黑麥草種子萌發(fā)特性的影響

2.1.1 發(fā)芽率和發(fā)芽勢 與對照相比，不同地理種群中華羊茅草粉均抑制了多年生黑麥草種子萌發(fā)，但抑制作用不盡相同。對Venus，E+種群處理的樣品中僅有99和141兩個(gè)種群處理的黑麥草種子的發(fā)芽率顯著低于對照(P<0.05)，而E-種群處理的樣品中，41、99、111和141種群處理的黑麥草種子的發(fā)芽率顯著低于對照(P<0.05)。而中華羊茅草粉對品種Esquire的抑制作用較弱，6個(gè)種群處理下，僅有99一個(gè)種群的E+和E-處理的黑麥草種子發(fā)芽率顯著低于對照(P<0.05)。而在同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，對品種Esquire，只有41處理的種子E+發(fā)芽率(83.33%)顯著高于E-的發(fā)芽率(P<0.05)，其他5個(gè)地理種群間無顯著差異。而對品種Esquire，E+和E-中華羊茅草粉之間均無顯著差異(圖1)。

圖1 不同地理種群中華羊茅草粉處理下多年生黑麥草種子的發(fā)芽率Fig.1 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on germination rate of perennial ryegrass注：大寫字母表示帶菌(E+) ,小寫字母表示不帶菌(E-) 的不同地理種群中華羊茅草粉對多年生黑麥草種子萌發(fā)之間差異顯著(P<0.05)；*表示同一地理種群中華羊茅帶菌(E+)和不帶菌(E-)之間具有差異顯著(P<0.05)，下同

多年生黑麥草種子發(fā)芽勢受到中華羊茅草粉E+和E-的影響。對品種Venus，E+種群處理的樣品中，41、99、111和141種群處理的黑麥草種子的發(fā)芽勢顯著低于對照(P<0.05)，而E-種群處理的黑麥草種子發(fā)芽勢均顯著低于對照(P<0.05)。而中華羊茅草粉對品種Esquire表現(xiàn)為E+種群中41、84、99和141種群處理的黑麥草種子的發(fā)芽勢顯著低于對照(P<0.05)，E-中均僅有41和99兩個(gè)種群處理的黑麥草種子發(fā)芽勢顯著低于對照(P<0.05)。而同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，對品種Venus，E+和E-中華羊茅草粉均無顯著差異。對品種Esquire，只有種群84和141的E+處理的黑麥草種子的發(fā)芽勢顯著低于E-處理的黑麥草種子的發(fā)芽勢(P<0.05)，其它4個(gè)地理種群間無顯著差異(圖2)。

圖2 不同地理種群中華羊茅草粉處理下多年生黑麥草種子的發(fā)芽勢Fig.2 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on germination energy of perennial ryegrass

2.1.2 發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù) Venus和Esquire的發(fā)芽指數(shù)隨著不同地理種群中華羊茅草粉的變化而變化(圖3)。對品種Venus，E+種群處理的樣品中，41、99、111和141種群處理的種子發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)，而E-種群處理的樣品種子發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照(P<0.05)。而中華羊茅草粉對品種Esquire表現(xiàn)為E+種群中41和99種群處理的黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)，E-中均僅有99一個(gè)種群處理的黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)。而同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，對品種Venus，只有57的E+處理的黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)(66.9%)顯著高于E-處理的黑麥草種子發(fā)芽率(P<0.05)，其他5個(gè)地理種群間無顯著差異。而對品種Esquire，種群84 E+處理的黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)顯著低于E-處理的黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)(P<0.01)，種群141 E+處理的黑麥草種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于E-發(fā)芽指數(shù)(P<0.05)，其他幾個(gè)地理種群間差異不顯著。

圖3 不同地理種群中華羊茅草粉處理下多年生黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)Fig.3 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on germination index of perennial ryegrass

在不同地理種群中華羊茅草粉處理下，多年生黑麥草的種子活力指數(shù)不同。品種Venus E+種群處理的樣品中，41、84、99、111和141種群處理的黑麥草種子的種子活力指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)，而E-種群處理的樣品中，41、57、99、111和141地理種群處理的黑麥草種子的種子活力指數(shù)均顯著的低于對照(P<0.05)。而中華羊茅草粉對品種Esquire表現(xiàn)為E+和E-種群中僅有99一個(gè)種群處理的黑麥草種子的種子活力指數(shù)顯著低于對照(P<0.05)，其他5個(gè)地理種群處理的黑麥草種子的種子活力指數(shù)與對照相比沒有顯著差異性。而同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，對品種Venus，只有種群57和111處理的黑麥草種子E+種子活力指數(shù)顯著高于E-的種子活力指數(shù)，其他4個(gè)地理種群間無顯著差異。而對品種Esquire，僅有種群99E+和E-中華羊茅草粉之間有顯著差異(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同地理種群中華羊茅草粉處理下多年生黑麥草種子的活力指數(shù)Fig.4 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on seed vigor index of perennial ryegrass

2.2 中華羊茅草粉對多年生黑麥草幼苗生長的影響

2.2.1 胚芽長和胚根長 不同地理種群中華羊茅內(nèi)生真菌共生體對多年生黑麥草胚芽的生長的作用不同。對品種Venus，E+種群處理的樣品中，84，111和141種群處理的黑麥草種子胚芽長顯著高于對照(P<0.05)，而E-種群中6個(gè)地理種群處理的黑麥草種子胚芽長與對照相比沒有顯著差異(P>0.05)。而中華羊茅草粉對品種Esquire表現(xiàn)為E+種群中僅有57，111兩個(gè)種群處理的黑麥草種子胚芽長顯著高于對照(P<0.05)，而E-種群處理的樣品中，57、111和141的胚芽長顯著高于對照(P<0.05)。而同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，對品種Venus，只有種群141處理的黑麥草種子E+胚芽長顯著高于E-的胚芽長(P<0.05)，其他5個(gè)地理種群間無顯著差異。而對品種Esquire，E+和E-中華羊茅草粉之間均無顯著差異(圖5)。

圖5 不同地理種群中華羊茅草粉處理下多年生黑麥草種子的胚芽長Fig.5 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on plumule length of perennial ryegrass

多年生黑麥草的胚根長受中華羊茅帶菌(E+)和不帶菌(E-)的影響。不同地理種群中華羊茅草粉處理品種Venus，E+種群處理的樣品中，41、84、99、111和141種群處理的黑麥草種子胚根顯著低于對照(P<0.05)，而E-種群中6個(gè)地理種群處理的黑麥草種子胚根長均顯著的低于對照(P<0.05)。Esquire經(jīng)中華羊茅草粉處理，6個(gè)地理種群處理的黑麥草種子E+胚根長均顯著高于對照的胚根長(P<0.05)，而E-種群除41處理的黑麥草種子外，其他5個(gè)地理種群處理的黑麥草種子胚根長均顯著高于對照(P<0.05)。而同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，對品種Venus，只有種群5處理的黑麥草種子的E+胚根長顯著高于E-的胚根長(P<0.05)，其他5個(gè)地理種群間無顯著差異。而對品種Esquire，E+和E-中華羊茅草粉之間均無顯著差異(圖6)。

圖6 不同地理種群中華羊茅草粉處理下多年生黑麥草種子的胚根長Fig.6 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on radicle length of perennial ryegrass

2.2.2 幼苗總生物量 不同地理種群中華羊茅草粉處理對多年生黑麥草幼苗的總生物量也產(chǎn)生不同程度的影響。對Venus，E+種群處理的樣品中99總生物量最大，各地理種群與對照相比差異不顯著(P>0.05)，而E-種群處理的樣品中，141總生物量最大，各地理種群與對照相比差異不顯著(P>0.05)。而中華羊茅草粉對品種Esquire，E+和E-種群處理的樣品，對照(CK)組的總生物量為0.003 8 g，與處理組差異不顯著(P>0.05)。而在同一地理種群的E+和E-中華羊茅草粉處理下，6個(gè)地理種群處理的黑麥草品種Venus的種子均無顯著差異(P>0.05)。僅有種群41E+處理的黑麥草品種Esquire的種子的總生物量顯著低于E-的總生物量(P<0.05)，其他5個(gè)地理種群間無顯著差異(P>0.05)(表2)。

2.2.3 不同地理種群中華羊茅草粉對2種多年生黑麥草幾項(xiàng)生長指標(biāo)影響的相關(guān)性分析 在不同地理種群中華羊茅草粉處理下，多年生黑麥草的生長指標(biāo)間的相關(guān)性不同。Venus的胚芽長與胚根長呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與鮮重呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，胚根長與根芽比呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，Esquire的胚芽長與鮮重呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表2 中華羊茅草粉處理下2種多年生黑麥草幼苗的總生物量

注：不同字母表示同一品種不同地理種群處理間差異顯著(P>0.05)

3 討論

種子和幼苗是植物生活史必經(jīng)的重要階段，其生長發(fā)育受生物和非生物脅迫的影響更為明顯，對環(huán)境的適應(yīng)能力直接的體現(xiàn)物種的競爭能力、分布范圍和豐富程度[21]。并且種子和幼苗也是植物生活史的薄弱環(huán)節(jié)，是建植的關(guān)鍵時(shí)期。試驗(yàn)以不同地理種群帶菌(E+)和不帶菌(E-)的中華羊茅草粉為材料，研究了不同地理種群E+和E-中華羊茅草粉對多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響，以模擬田間自然條件下中華羊茅生長對多年生黑麥草的作用，結(jié)果表明中華羊茅草粉對多年生黑麥草的萌發(fā)具有一定的抑制作用。

Venus與對照相比，E+種群99和141處理的樣品對多年生黑麥草種子發(fā)芽率有抑制作用，E+種群41、99、111和141處理的樣品對多年生黑麥草種子發(fā)芽勢、種子活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和胚根長具有抑制作用；對Esquire，E+種群99處理的樣品對多年生黑麥草種子發(fā)芽率和活力指數(shù)具有抑制作用，E+種群41和99處理的樣品均對多年生黑麥草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)有抑制作用。研究表明，2種不同生態(tài)型受Neotyphodiumlolii侵染的多年生黑麥草其產(chǎn)生的生物堿含量不同[27]。內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝物參與了植物的化感作用中，對多年生黑麥草的生長產(chǎn)生了抑制作用。不同種群的中華羊茅生態(tài)型具有明顯的差異性，且禾草內(nèi)生真菌與不同生態(tài)型和生境的相互作用也對周圍共生植物有顯著的影響。Venus與對照相比，E-的6個(gè)種群均對其發(fā)芽勢，發(fā)芽指數(shù)和胚根長具有抑制作用；Esquire，E-種群99處理的樣品對多年生黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和種子活力指數(shù)均具有抑制作用。這與黃璽等[28]在不帶菌醉馬草提取液濃度為0.20 g/mL條件下對針茅(Stipacapillata)和硬質(zhì)早熟禾(Poasphondylodes)幼苗生長具有顯著抑制作用的結(jié)果相一致。與E-相比，E+種群除41外，其他5個(gè)地理種群均對黑麥草的胚根長具有促進(jìn)作用，與南志標(biāo)等[8]研究的內(nèi)生真菌可顯著促進(jìn)布頓大麥草生長的結(jié)果相似。Venus和Esquire的胚芽長與鮮重均呈顯著正相關(guān)。與E-相比，種群41E+中華羊茅草粉顯著抑制了Esquire品種的總生物量(P<0.05)。這與Prestidge[28]研究發(fā)現(xiàn)E+多年生黑苗草水浸提液抑制白三葉根長和苗長的結(jié)果一致。Springer[27]的研究也證明了E+高羊茅對三葉草生長的抑制作用強(qiáng)于E-。

表3 中華羊茅草粉作用下2種多年生黑麥草6項(xiàng)生長指標(biāo)間的相關(guān)性

4 結(jié)論

不同地理種群中華羊茅E+與E-草粉對黑麥草的化感作用不同，且不同受體植物對同一地理種群中華羊茅的表現(xiàn)不同。中華羊茅內(nèi)生真菌能促進(jìn)寄主產(chǎn)生化感物質(zhì)提高其與其他植物的競爭能力。研究結(jié)果表明，在模擬同一生境下，伴生草種中華羊茅對多年生黑麥草的生長具有抑制作用，且不同生態(tài)型對其抑制作用不同。