劉梅潔，鞠大宏，王瑞海，孫 剛，潘靜華，李 艷，劉 紅，王少君，苗 青，許 京，劉麗梅△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究北京市重點實驗室，北京 100700；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所, 中醫(yī)方證基礎(chǔ)研究中心， 北京 100700)

秦皮是傳統(tǒng)中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載秦皮“主風(fēng)寒濕痹”。骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)骨痹、骨痿范疇。本研究采用經(jīng)典的去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥模型，對秦皮治療骨質(zhì)疏松癥的作用進(jìn)行了初步評價，以期為進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

選用健康雌性SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20) g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(許可證編號SCXK-(軍)2012-0004)，在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級實驗動物室飼養(yǎng)(實驗動物室許可證號SYXK(京)2010-0032)。

1.2 藥物

秦皮藥液：秦皮飲片3 kg，按優(yōu)選工藝(加9倍量水，煎煮3次，每次1.5 h)藥液合并，減壓回收溶劑，濃縮至0.67 g生藥/ ml。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉，德國MERCK公司(批號20131206)；鹽酸四環(huán)素，北京索萊寶科技有限公司(批號1104B047)；甲基丙烯酸甲酯，天津市福晨化學(xué)試劑廠(批號20140427)；甲基丙烯酸丁酯，天津市福晨化學(xué)試劑廠(批號20130417)；聚乙二醇400，天津市福晨化學(xué)試劑廠(批號20110527)；苯甲酸甲酯，國藥集團化學(xué)試劑有限公司(批號20120627)；過氧化苯甲酰，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司(批號20040610)；N,N-二甲基對甲苯胺(N,N-Dimethyl-p-toluidine)，美國Sigma公司(批號04327 MB-235)；OPG抗體，美國Abcam公司(批號GR187782-2)；RANKL抗體，美國Abcam公司(批號GR10701-10)。

1.4 儀器

2040切片機,德國Reicheit-Jung公司;FINESSE ME+全自動石蠟切片機;美國Thermo公司;Pannoramic MIDI組織切片掃描儀;匈牙利3D HISTECH公司；Pannoramic viewer與Quant center圖像分析軟件，匈牙利3D HISTECH公司。

1.5 分組及處理

選用健康雌性SD大鼠40只，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組10只、假手術(shù)組10只、造模組各20只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將造模組大鼠以45 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹位固定行雙側(cè)卵巢切除術(shù)[1]。假手術(shù)組處理方法同造模組，但只切除小塊脂肪組織不摘除卵巢。術(shù)后10 d，將造模組大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和秦皮組各10只。隨后秦皮組大鼠給予秦皮水煎液(0.67 g生藥/kg·d)每日1次，連續(xù)6 d，休息1 d，再連續(xù)給藥6 d，如此給藥3個月?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組和模型組按同法灌服等體積純凈水。

各組大鼠于處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30 mg/kg體質(zhì)量，并對骨組織進(jìn)行熒光標(biāo)記[2]。給藥結(jié)束后將大鼠處死，取左側(cè)脛骨制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的檢測；取右側(cè)脛骨制作大鼠脛骨脫鈣骨的石蠟切片，用于檢測大鼠脛骨骨髓中OPG和RANKL 的蛋白表達(dá)。

1.6 指標(biāo)檢測

骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)測定[3]：分別檢測骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁礦化率(MAR)和類皮質(zhì)平均寬度(OSW)。大鼠脛骨骨髓中OPG和RANKL的蛋白表達(dá)檢測：采用免疫組化法分別檢測脛骨骨髓中OPG和RANKL蛋白表達(dá)。圖片經(jīng)Pannoramic MIDI組織切片掃描儀掃描完成后，采用Quant center中的densito quant軟件自動識別并設(shè)置組織切片上所有的深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對每個組織進(jìn)行識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的面積(像素)和陽性的百分比，最后進(jìn)行H-score評分。H-SCORE 即 histochemistry score(組織化學(xué)評分)的縮寫，是處理免疫組化結(jié)果的一種組織學(xué)評分方法，將每張切片內(nèi)陽性的細(xì)胞數(shù)量及其染色強度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，達(dá)到對組織染色半定量的目的。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 秦皮對卵巢切除大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的影響

表1圖1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術(shù)組，TRS%、TFS%、OSW和MAR均明顯高于假手術(shù)組。與模型組比較，秦皮組大鼠脛骨TBV%明顯增高，但仍顯著低于假手術(shù)組；TRS%、TFS%、OSW和MAR均明顯降低。

表1 各組大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)變化比較

注：與假手術(shù)組比較:*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

圖1 各組大鼠脛骨骨小梁分布情況(甲苯胺藍(lán)染色 ×5)

2.2 秦皮對卵巢切除大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響

表2圖2、3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達(dá)綜合評分顯著降低，而RANKL蛋白表達(dá)綜合評分顯著增高；秦皮組大鼠OPG蛋白表達(dá)綜合評分顯著高于模型組，而RANKL蛋白表達(dá)綜合評分顯著低于模型組，與假手術(shù)組比較仍有明顯差異。

表2 各組大鼠OPG、RANKL蛋白表達(dá)變化比較

注：與假手術(shù)組比較:*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01

與空白對照組比較，假手術(shù)組上述各項指標(biāo)均無顯著差異，從而排除了手術(shù)因素對實驗的影響。

圖2 各組大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達(dá)比較(免疫組化染色 ×10)

圖3 各組大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達(dá)比較

3 討論

秦皮為傳統(tǒng)中藥材，在臨床主要用于治療細(xì)菌性痢疾等炎癥性疾病[4-5]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，秦皮“主風(fēng)寒濕痹”。有研究表明，中藥秦皮能明顯降低骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的前列腺素E2(PGE2)水平[6]，而PGE2可激活破骨細(xì)胞，有很強的促進(jìn)骨吸收作用。這一研究也提示，秦皮可能通過抑制PGE2水平而對骨質(zhì)疏松癥的防治產(chǎn)生影響。秦皮乙素是秦皮的主要化學(xué)成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素在50～100 mg/kg劑量下在體內(nèi)表現(xiàn)出雌激素效果，秦皮乙素的弱雌激素樣作用可在絕經(jīng)后的治療中發(fā)揮作用[7]；而雌激素可有效控制破骨細(xì)胞的骨吸收作用，其水平下降可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。Yamada等報道，秦皮乙素通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶proMMP-1和proMMP-3合成、分泌及其活性，用于治療骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎造成的軟骨損傷[8]；而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)參與骨的重塑和構(gòu)建，且表達(dá)骨吸收活性。秦皮素亦是秦皮的主要化學(xué)成分。Kuo等利用人成骨細(xì)胞MG-63細(xì)胞研究表明，在秦皮素介導(dǎo)的成骨細(xì)胞成熟和分化過程中，是通過促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和4(BMP-2、BMP-4)的產(chǎn)生來影響其分化過程[9-10]。綜合上述研究結(jié)果我們推測，秦皮藥材在治療細(xì)菌性痢疾和骨關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病之外，對于骨質(zhì)疏松癥亦有一定的防治作用。

本研究表明，切除大鼠卵巢3個月后，與假手術(shù)組比較，模型組衡量骨量水平的TBV%顯著降低，而反映骨吸收情況的TRS%以及反映骨形成情況的TFS%、MAR和OSW則明顯增加，表明切除卵巢所造成的是一種骨吸收大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥動物模型，這與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理特點相一致[11-12]。給藥3個月后，秦皮組的TBV%較模型組明顯增加，與模型組比較，秦皮組的TRS%、TFS%、MAR和OSW均顯著降低。這一結(jié)果表明，該劑量的秦皮藥液對去卵巢所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用，其對骨形成和骨吸收環(huán)節(jié)均有一定的調(diào)節(jié)作用。

RANKL是能夠直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育并使之激活的惟一細(xì)胞因子，它與破骨細(xì)胞表面的RANK相結(jié)合，強有力地促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成、分化、成熟，并能增強破骨細(xì)胞運動能力，同時還可以抑制破骨細(xì)胞的凋亡，延長其存活時間[13]。而OPG又稱為骨保護素，它可以通過與RANKL的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，從而抑制骨吸收，減少骨量的丟失。因此，OPG/RANKL通路是非常重要的破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號通路。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)OPG蛋白表達(dá)顯著降低，而RANKL蛋白表達(dá)顯著增加，這應(yīng)該是模型組大鼠骨量丟失的機理之一。而秦皮藥液后，大鼠的OPG和RANKL的蛋白表達(dá)均有不同程度的逆轉(zhuǎn)，這說明該劑量的秦皮對OPG/RANKL破骨細(xì)胞分化通路有一定的調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)OPG蛋白的分泌而抑制RANKL蛋白的分泌，從而對骨代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。綜合上述實驗結(jié)果可以看出，秦皮對去卵巢所致的骨質(zhì)疏松癥有較為明顯的治療作用。其作用途徑是對OPG/RANKL破骨細(xì)胞分化通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)OPG蛋白的表達(dá)而抑制RANKL蛋白的表達(dá)，從而抑制過度增強的破骨細(xì)胞活性，降低卵巢切除所導(dǎo)致過高的骨轉(zhuǎn)換率，進(jìn)而防止骨量的快速丟失。