王生存，李碧春

腫瘤診斷和治療的進步改善了疾病的預后，使患者的生存率大大提高。然而，化療或放療可能會導致卵巢早衰，危害患者的生育力。此外，腫瘤的發(fā)病呈年輕化趨勢，女性患者保留生育力的需求亦逐漸增加。卵巢組織冷凍保存和移植是即將接受癌癥放化療治療的女性保存生育力最主要和最可行的選擇[1]。特別是一些兒童患者沒有成熟卵泡可保存，更無法凍存胚胎，最可行的方案是卵巢組織的冷凍保存，該方法可儲存大量的原始卵泡和初級卵泡并且能夠確保卵巢內分泌功能的恢復[2]。然而，卵巢組織移植仍然存在很多挑戰(zhàn)，比如怎樣在冷凍和移植過程中減小卵泡的損傷和丟失。

半個多世紀前，一項關于小鼠的研究首次報道了經過冷凍保存的整個卵巢組織原位移植后成功生育[3]。2004年Donnez等[4]報道了第一例人類利用卵巢組織冷凍保存和移植獲得的活產兒，這是人類生殖醫(yī)學史上的一個里程碑。研究人員也一直在尋找恢復人類、非人類靈長目動物、家養(yǎng)動物[5]或實驗動物[6]生育力的最佳方法。

卵巢的自然可塑性有利于其移植到不同的部位，因為其含有天然豐富的血管生成因子，有利于新血管形成，使血管重建并迅速恢復正常生理功能。卵巢組織可以被原位移植到盆腔或異位移植到皮下區(qū)域、腎被膜、脂肪墊以及其他部位[7]。根據(jù)移植部位的不同，可分為原位移植和異位移植；根據(jù)移植受體的不同，可分為異種移植、同種異體移植和自體移植。

1 卵巢組織移植部位

1.1 原位移植 原位移植即組織移植到其起源位置或者盆腔。在這種類型的移植中，組織被重新植入其原始生理環(huán)境中。卵巢組織原位移植的主要優(yōu)點是不需要輔助生殖技術的干預就可以自然妊娠。Donnez等[8]報道，與異位移植相比，盆腔可為卵泡發(fā)育提供最佳的環(huán)境，這是因為盆腔的溫度、壓力、旁分泌因素和血液供應與卵巢正常生理狀況下相似。其缺點是由于受體殘存卵巢或卵巢窩發(fā)生萎縮，容積變小，可容受的卵巢組織體積受限；另外，原位移植是一種侵入性操作，可能導致嚴重的盆腔粘連。

在動物生產中，第一個令人鼓舞的結果是由Gosden等[9]于1994年在綿羊中獲得的，報道了通過慢速冷凍保存的卵巢組織在原位自體移植后恢復發(fā)情周期、成功妊娠并獲得活產。隨后，Salle等[10]和Bordes等[11]也報道了使用玻璃化冷凍的卵巢原位移植在母羊獲得活產。此外，Santos等[12]研究證明在沒有激素的補充下，經冷凍和原位自體移植的小的卵巢切片在雙側卵巢切除的山羊體內可以完成卵泡發(fā)育并恢復內分泌功能。

目前有兩種方法成功地用于新鮮或冷凍復蘇后的卵巢組織原位移植：在腹膜開一個特殊的小窗或在殘余的卵巢上開一個特殊的窗口。卵巢的大塊組織（8 mm×5 mm～10 mm×5 mm）可以在去除天然皮質后縫合到殘余的卵巢中。然而，由于無法縫合，在髓質空間移植小塊組織（2 mm×2 mm）十分困難。此外，Silber等[13]報道在8例同卵雙胞胎之間原位移植新鮮和冷凍保存的卵巢組織，77～142 d后月經周期和血清卵泡刺激素（FSH）水平恢復正常，其中6例患者自然受孕7次，已獲得3例活產。Burmeister等[14]也報道了澳大利亞第一例人類卵巢組織冷凍保存和原位自體移植成功妊娠，這是乳腺癌患者化療后移植卵巢保存生育力的成功案例。

1.2 異位移植 異位移植是在組織冷凍保存過程之后移植到不同的部位或者卵巢外部其他區(qū)域，比如腹壁、前臂、腎被膜或者乳房等部位。異位移植的潛在優(yōu)點包括：避免侵入性操作；容易接近移植物；增加皮質切片的體積；即使因嚴重的盆腔粘連不能進行原位移植，異位移植也是可行的。另外，異位移植不需要全身麻醉，而且動物實驗中移植塊的去除相對容易。然而，與原位移植不同，卵巢組織異位移植主要是為了維持機體正常激素水平以及保存卵細胞，受孕需要體外受精。

卵巢組織可以移植在皮下區(qū)域和腎囊等各種囊腔，這些部位血液供應良好能夠提高移植物的存活率[7]，最常用的移植部位是腎被膜。與小鼠的皮下區(qū)域相比，腎囊處的移植成功率和卵母細胞產率顯著提高[7]。無論移植部位如何，移植后到血管重建前這個階段，卵巢移植物可能發(fā)生缺血和潛在的卵泡閉鎖，這個過程對該技術的成功仍然是一個挑戰(zhàn)。然而，由于代謝速率低，原始卵泡對缺氧有一定的耐受力[15]。

目前，人類和其他靈長目動物的卵巢異位移植經驗非常有限。已經在人類中測試了幾個異位部位，包括子宮闊韌帶、腹直肌、前臂、乳房組織、腹部皮下組織和腹膜下組織。在靈長目動物的研究中，也使用了其他異位部位（網膜、腹膜后髂窩、子宮漿膜、輸卵管系膜和骨盆壁）。除了腹膜內或腹膜下外，腹部的皮下組織也可以為人類和靈長目動物的卵泡生長提供適當?shù)沫h(huán)境[12]。然而，與腹腔環(huán)境相比，由于溫度、旁分泌因素和血液供應的不同，異位部位也許不能提供卵泡發(fā)育的最佳環(huán)境。靈長目動物模型已經被用于尋找合適的移植部位來克服這些挑戰(zhàn)[16]。人類冷凍保存的青春期前卵巢組織的異位異種移植后卵泡存活率高，是由于移植物中保留有大量的休眠原始卵泡。此外，Stern等[17]首次報道雙側卵巢切除術后婦女冷凍保存的卵巢組織異位移植后獲得臨床妊娠。因此，移植部位的選擇是未來移植卵巢存活和卵母細胞活力的一個重要決定因素。

2 卵巢組織的移植受體

2.1 異種移植 免疫缺陷小鼠已被用來評估卵巢組織冷凍保存后的卵泡發(fā)育和生存潛能。一些研究表明，將人卵巢組織異種移植到小鼠體內已經成為研究體內卵巢功能和卵泡發(fā)育的有效模型。自1960年以來，裸鼠已經成為建立人類惡性腫瘤體內模型的標準。由于缺少胸腺，裸鼠不能產生成熟的T淋巴細胞，因此不能產生大多數(shù)類型的免疫應答[18]。這種T細胞功能的缺失不僅防止裸鼠排斥同種異體移植物，甚至防止其排斥異種移植物[18]。另一個模型是使用重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠[18]。SCID小鼠是卵巢異種移植第一個也是最常用的模型，其特征是scid突變，導致抗原受體基因重組缺陷，削弱了產生B/T淋巴細胞的能力。SCID小鼠可以維持異種組織的存活，而不會表現(xiàn)出移植物抗宿主反應，因此其可以作為移植研究的良好模型。在SCID小鼠產生幾年后，有學者將scid突變轉移到非肥胖糖尿病（NOD）上，形成NOD-SCID小鼠，其除了B/T淋巴細胞缺陷外，還降低了自然殺傷（NK）細胞的活性。此外，NOD-SCID小鼠激活補體系統(tǒng)某些組分功能受損，并且顯著缺乏巨噬細胞。

為了建立人卵巢基質皮下移植小鼠模型的新方案，將正常人卵巢組織皮下植入SCID小鼠中，然后通過免疫組織化學鑒定植入物。結果表明人卵巢組織在SCID小鼠宿主中成功存活并保留了原始正常卵巢組織的性質[19]。Luyckx等[20]曾報道，凍融青春期前患者的腔前卵泡可以在長期卵巢異種移植后成功存活和發(fā)育。Henry等[21]將綿羊卵巢異種移植到SCID和NOD-SCID小鼠后的研究表明，它們都適用于移植物恢復的研究，但是根據(jù)組織學分析，SCID小鼠的卵巢整體組織形態(tài)保持得更好。在將大鼠卵巢異種移植到免疫缺陷小鼠的腎囊中后，卵巢代謝和功能相關基因表達水平顯著改變。Ishijima等[22]研究也證明在免疫缺陷小鼠異種移植犬凍存卵巢后卵泡丟失比例較高。此外，已經證明在SCID小鼠異種移植過程中，用血管內皮生長因子165（VEGF165）在膠原基質中包裹卵巢組織使得功能性血管形成和早期血運重建更快[21]。Lotz等[23]報道1例6歲女孩的卵巢切片異種移植122 d后，在沒有外源性激素刺激的情況下形成竇狀卵泡。此外，研究表明分離的人類卵泡被封裝后能夠在纖維蛋白凝塊和短期異種移植中生存[24]。

2.2 自體移植或同種異體移植 如前所述，臨床上人類卵巢組織移植的主要目標是恢復接受放化療婦女的生育力和內分泌功能。目前，至少有10個國家的研究小組已經證明，凍存卵巢組織移植是保留女性癌癥患者生育力的潛在選擇[25]。卵巢組織冷凍保存允許立即開始癌癥治療，與其他技術（例如胚胎或卵母細胞冷凍保存）相比，其不需要預先卵巢刺激和精子捐獻。

因為有些研究不直接參與臨床，其主要焦點是動物生產的生物技術，所以很難統(tǒng)計所有科研實驗或臨床實踐中卵巢組織的確切移植次數(shù)。Donnez等[8]也提出，世界范圍內進行的卵巢組織移植手術數(shù)量尚不可知。然而，在美國、比利時、法國、西班牙、丹麥和以色列等國家都有成功的案例。此外，日本、意大利、德國和澳大利亞的研究小組也報道了成功案例[26]。應用該策略除了可以獲得良好的卵巢功能恢復率（95%）和一定的妊娠率（23%）之外，卵巢功能持續(xù)時間約為4～5年[27]。

自體移植卵巢組織只有在移植物中沒有癌細胞的情況下才可以進行，并且在進行卵巢移植時對惡性細胞的復種應該有所警惕。卵巢組織冷凍保存和自體移植的缺點包括卵巢移植物的壽命有限，這是由于潛在的移植后缺血引起的卵泡閉鎖。此外，對于自身免疫性或遺傳性疾病患者，性腺自體移植對保持生育力無效。在這種情況下，同種異體移植是可能的解決方案。Silber等[13,28]共報道了9對同卵雙胞胎，通過卵巢同種異體移植救治不育的一方。另外，原位卵巢同種異體移植已經在Turner綜合征的患者中進行。這種技術能夠恢復患者正常的月經周期和排卵，維持正常的激素水平，并刺激第二性征的發(fā)育。然而，Scott等[29]研究表明，免疫抑制治療如環(huán)孢菌素A聯(lián)合類固醇是卵巢移植物存活所必需的。

3 影響移植卵巢組織功能的因素

卵泡丟失是卵巢移植后的主要問題之一，其與以下幾個方面有關。

3.1 卵巢組織大小 冷凍之前卵巢皮質的厚度對于冷凍保護劑的灌注和確保移植物存活至關重要。為了確保冷凍保護劑的良好滲透和清除，移植物的表面積與體積之比必須很高，降低凍融期間冰凍損傷的可能性以及減少在移植后初始階段的缺血缺氧。目前普遍通過慢速冷凍或玻璃化方法將卵巢皮質組織冷凍保存在1～2 mm厚的條帶中。有學者提出減小移植物的尺寸可能會增加氧氣、生長因子和營養(yǎng)物質向缺血移植物的擴散，并改善卵泡的存活率[30]。然而，Gavish等[31]研究表明在小鼠中異種移植牛卵巢組織1周后有廣泛新生血管形成，當移植物厚度減少超過1 mm時，并沒有發(fā)現(xiàn)有益的效果，廣泛的原始卵泡喪失和卵泡損傷增加而沒有改善新血管形成。此外，移植的卵巢皮質切片僅含有一部分個體的卵巢儲備，因此只能在供體移植物中所含的卵母細胞供應消耗之前，為受體提供相對短暫的生育期。這一限制意味著冷凍保存和自體移植的卵巢皮質切片作為恢復老年患者生育能力的一種手段似乎不太有效，這些患者在組織保存時卵泡密度已經很低，并且與內分泌紊亂有關。在這種情況下，整個卵巢的冷凍保存為自體移植提供了一個保存生育力最有效的替代策略，因為其可以恢復卵巢內的所有原始卵泡。此外，由于整個卵巢移植需要血管吻合而不是皮層血運重建，因此這種干預措施不會導致缺血引起的卵巢儲備功能顯著下降、內分泌紊亂，還可減少限制這種生育力保存技術效果的年齡因素的影響[32]。然而，凍融整個卵巢的自體移植也存在一些缺點，包括：①由于冷凍保護劑在整個卵巢中的擴散不充分以及在卵巢核心和外周之間冷卻速度不均勻，在冷凍期間具有較高的冷凍損傷風險；②卵巢血管冷凍損傷；③由于卵巢動脈直徑小（≤0.5 mm）、卵巢血管蒂短（≤5 cm），移植物與受體血管的直徑不一致以及微血管吻合可能失敗，導致血管吻合手術困難；④手術后血管并發(fā)癥的發(fā)生風險較高，如吻合口出血、假性動脈瘤、血管狹窄或微血管血栓形成；⑤卵巢整體的血管并發(fā)癥可嚴重影響整個卵巢的存活，使其他方式的移植嘗試不再有可能。

3.2 局部缺血 局部缺血是指動脈或靜脈血流灌注不足和減少，細胞能量儲存耗竭并有導致細胞死亡的毒性代謝產物的積累。持續(xù)數(shù)日的缺血最可能引起深度和不可逆的缺血-再灌注損傷，是造成卵泡丟失的原因，因為移植物需要4～5 d的時間進行再氧合。一項綿羊卵巢組織移植的研究表明，移植新鮮組織后，65%的卵泡丟失，當冷凍組織融化時會增加7%的卵泡丟失。此外，移植到裸鼠中的新鮮或冷凍人卵巢組織顯示卵泡密度降低，表明缺血是卵泡消耗的主要因素。因此，新血管形成之前缺血的持續(xù)時間對于卵泡的存活至關重要，并且可能是造成移植后卵泡損失的主要原因。

缺血性損傷的機制涉及能量消耗和再灌注氧化應激，可能導致脂質、DNA、酶和結構蛋白的損傷，從而導致細胞死亡。幾種炎癥因子的基因表達由缺氧敏感的反應元件和核因子κB（NF-κB）激活，嗜中性粒細胞和巨噬細胞向組織內轉移，導致組織破壞和纖維化。然而，由于原始卵泡的代謝需求非常低，其在移植后新生血管形成前相對較長時間缺血的情況下仍能存活。而且，它們分布在卵巢表面之下，從位置上看可能是最先從新血管向內生長中受益的。關于冷凍保存的牛卵巢皮質的研究證實，與原始卵泡相比，基質細胞更易缺血。由于缺血對卵泡池的負面影響，因此血管生成速度是卵泡存活的關鍵機制。

4 添加外源性物質改善血管生成和卵巢移植

許多動物實驗著重于改善卵巢組織的存活。凍融卵巢組織在動物模型中移植可使竇卵泡發(fā)育并成功活產。盡管冷凍保存和卵巢組織自體移植獲得了成功，但移植也導致大量的卵泡損失[31]。在這方面，許多研究使用抗氧化劑或血管生成因子等進行改善[33-34]。移植前局部注射抗氧化劑維生素E可以提高卵泡存活率。Donnez等[8]研究表明，藥物可以刺激移植物的血管再生，如VEGF或鞘氨醇1磷酸（S1P），可以減少抑制物缺血和氧化應激反應。2011年Zelinski等[35]的一項研究表明，S1P及其類似物可以保護靈長目動物的卵巢免受輻射引起的損害。此外，Scalercio等[36]于2015年指出，用維生素E類似物trolox預處理卵巢組織，可以改善卵巢組織的卵泡質量，避免其在基質細胞中發(fā)生凋亡。此外，有研究表明，每天給予自體卵巢移植小鼠左旋肉堿，直到術后7 d，可抑制卵泡凋亡、減輕氧化損傷，并提高卵巢移植物中卵泡的存活率和功能[37]。

到目前為止，卵巢冷凍保存和移植程序幾乎僅限于無血管皮質切片。無血管吻合的小皮質切片的存活完全依賴于移植后新生血管的形成。為了減少卵巢組織移植后的缺氧時間并改善卵泡存活率，可以通過VEGF刺激血管生成，VEGF是調節(jié)新血管形成的主要信號蛋白[21]。已有研究表明，VEGF通過在粒層細胞中表達的兩種酪氨酸激酶家族受體起作用，即VEGF受體1（VEGFR-1）和VEGFR-2。有研究使用SCID小鼠異種移植模型分析2種VEGF-A亞型VEGF111和VEGF165的作用[38]。VEGF111是可溶的并且對蛋白水解具有抗性，而VEGF165錨定于細胞外基質。這2種VEGF亞型均可增加血管恢復和功能性血管生成。在膠原蛋白基質中使用VEGF111和VEGF165可以改善移植后卵巢皮質的血管生成并減少缺氧，從而增強原發(fā)性卵泡的保存。此外，已證實小鼠異種移植過程中在膠原蛋白基質中用VEGF165包裹卵巢組織，可更快速地發(fā)生功能性血管生成和移植物的早期血運重建[21]。此外，Campbell等[32]使用抗血栓形成藥物阿司匹林的術后方案來減少移植后局部缺血。

移植冷凍保存的卵巢組織有助于青春前期和育齡期女性或患有癌癥、治療不能延遲需進行輔助生殖技術（如卵母細胞或胚胎冷凍保存）的患者。由于內膜準備和刺激取卵通常需要2～3周或更長的時間，所以一般不可能將成年癌癥女性的胚胎冷凍以備將來使用。而且，并非所有的患者都有伴侶可以進行胚胎冷凍保存。此外，與卵母細胞和胚胎相比，年齡和月經周期不影響卵巢組織的冷凍保存，也較少涉及倫理和社會問題。

大多數(shù)凍存卵巢組織移植的研究具有重建生育力的目的[37]。然而，在特殊情況下，如當由于癌癥或盆腔器官感染需要切除正常卵巢時，卵巢激素的缺乏可能導致內分泌紊亂，如骨質疏松癥、性欲減退、性功能障礙和脂蛋白水平增加。這種情況下，凍存卵巢組織的移植是克服該問題的主要方法。然而，盡管凍存卵巢組織移植取得了良好的效果，但成功恢復凍融卵巢皮質生育力的主要障礙是新血管生成前粘連和卵泡大量缺血性損傷。因此，卵巢移植的優(yōu)化可能需要準備適當?shù)慕M織厚度和移植的最佳部位，從而避免組織缺血并促進快速血運重建。仍需要進一步的動物模型研究來開發(fā)女性卵巢冷凍移植優(yōu)化方案。

5 結語與展望

綜上所述，經低溫冷凍保存后的卵巢組織可以保存數(shù)量可觀的原始卵泡，并且結構完整，具有活力及發(fā)育潛能，而且已經直接用于臨床成功獲得妊娠。因此，將凍存卵巢組織作為保存生育力的方法具有非常廣闊的應用前景[39]。這意味著卵巢冷凍移植技術有可能充分利用女/雌性生殖細胞用于人類輔助生殖、建立動物基因庫和瀕危動物保種等。