李文清

(青海省中醫(yī)院檢驗科,西寧 810000)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是以髖部、腰部、頸部等關節(jié)疼痛為臨床表現(xiàn)的一種慢性炎癥性關節(jié)疾病,多認為是由感染、免疫或遺傳等因素引發(fā),患者骶髂關節(jié)、肌腱及一些肌腱附著點被炎性細胞浸潤,引起外周關節(jié)炎,對生活質量造成嚴重影響。研究表明[1],T淋巴細胞免疫反應在機體自身免疫疾病發(fā)生過程中起重要作用,可參與調(diào)控體內(nèi)免疫平衡。輔助性T細胞17(T helper cells 17,Th17)在CD4輔助性T細胞(T helper cells,Th)亞群中以分泌促炎細胞因子IL-17被廣泛認知,其與具有抑制炎癥反應作用的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg細胞)在機體中的平衡狀態(tài)對自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。微小核糖核酸-155(microRNA-155,miR-155)是微小核糖核酸(microRNA,miRNA)家族中可對T細胞增殖、分化起調(diào)節(jié)作用的一種多功能miRNA,在自身免疫疾病患者外周血中異常表達。目前學術界對強直性脊柱炎患者外周血中miR-155、Th17、Treg表達水平已多有研究[3],但對miR-155表達與Th17/Treg平衡的關系卻鮮有報道。本研究擬對AS患者外周血中miR-155表達水平和Th17、Treg細胞分布狀態(tài)進行測定,探討AS患者外周血miR-155表達與Th17/Treg平衡的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017-04～2018-04在本院診治的AS患者64例為研究對象,其中男35例,女29例,年齡20-67歲,平均年齡(33.26±5.74)歲,病程1-9年,平均病程(3.58±1.65)年。另取同期在本院體檢健康志愿者60例為對照組,其中男32例,女28例,年齡22-68歲,平均年齡(35.84±6.19)歲。兩組研究對象在年齡、性別等基本資料方面比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 納入與排除標準

納入標準:①經(jīng)1984年美國風濕病協(xié)會修訂的AS診斷標準[4]確診為AS患者;②納入研究前3個月未進行過免疫調(diào)節(jié)治療;③患者知曉并同意本次研究,簽署知情同意書。排除標準:①妊娠期、哺乳期患者;②合并其他風濕性疾病患者;③合并肝、腎、心腦血管等器官系統(tǒng)疾病患者;④精神不正?；颊?。

1.3 主要儀器與試劑

5 ml EDTA抗凝管、肝素鈉抗凝管(上海生工),PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司),TRIzol試劑(美國Invitrogen公司),逆轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司),IL-6、IL-17、IL-23ELISA檢測試劑盒(上海晶美生物技術有限公司),流式細胞儀(美國BD公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 外周血單個核細胞中miR-155、Foxp3 mRNA水平測定 于清晨采集研究對象空腹靜脈血5 ml,置于EDTA抗凝管中,采用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC),采用熒光定量PCR法對miR-155、叉頭翼狀螺旋轉錄因子(forkhead/winged helix transcription factor p3,Foxp3)表達水平進行測定,采用TRIzol法提取總RNA,按照逆轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA,miR-155以U6為內(nèi)參,進行定量PCR反應,條件:95 ℃預變性3 min,94 ℃ 1 min,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共進行45個反應循環(huán)。Foxp3 mRNA以GAPDH為內(nèi)參,條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共進行40個反應循環(huán)。引物序列見表1。

表1定量PCR引物序列

Table1QuantitativePCRprimersequences

基因 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′)miR-155GCGAAAGCATTTGCCAAGAACATCACAGACCTGTTATTGCU6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGFoxp3AGGAAAGGAGGATGGACGGTGGCTGGTTGTGAAGGGAPDHCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTCCACCACCCTGTTGCTGTAG

1.4.2 Th17、Treg細胞分布狀態(tài) 于清晨采集研究對象空腹靜脈血5 ml,置于肝素鈉抗凝管中,分離PBMC并收集提純后的PBMCs,將細胞濃度調(diào)整為1×106/ml接種于6孔板中,加入佛波醇乙酯25 ng/ml 2 μl,離子霉素1 μg/ml 10 μl,放入37 ℃無菌細胞培養(yǎng)箱中,1 h后向加1 μl高爾基阻斷劑,培養(yǎng)4-6 h后收集細胞。以CD4-FITC設門,固定,破膜,采用IL-17A PE(5 μl)標記Th17細胞,CD4+IL-17A+的細胞被標記為Th17細胞;采用CD25-PC(5 μl)、CD25 PE(5 μl)標記Treg細胞,CD4+CD25+CD127low的細胞被標記為Treg細胞。采用流式細胞儀檢測Th17、Treg細胞百分率,檢測結果以陽性細胞百分數(shù)及陽性細胞的熒光強度表示。

1.4.3 Th17、Treg細胞相關細胞因子血清水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定研究對象血清白細胞介素2(interleukin 2,IL-2)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、白細胞介素10(interleukin 10,IL-10)、白細胞介素17(interleukin 17,IL-17)、白細胞介素23(interleukin 23,IL-23)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-Β,TGF-β)水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 外周血單個核細胞中miR-155、Foxp3水平測定結果

AS患者外周血單個核細胞中miR-155相對表達量顯著高于對照組(P<0.05),Foxp3相對表達量顯著低于對照組(P<0.05,見表2)。

表2對照組與AS組外周血單個核細胞中miR-155、Foxp3水平測定結果

Table2LevelsofmicroRNA-155andFoxp3inperipheralbloodmononuclearcellsincontrolgroupandASgroup

組別nmiR-155相對表達量Foxp3相對表達量對照組601.04±0.211.42±0.33AS組641.75±0.380.64±0.17 t12.98416.381 P0.0000.000

2.2 Th17、Treg細胞比率測定結果

AS組Th17細胞比率顯著高于對照組(P<0.05),Treg細胞比率顯著低于對照組(P<0.05,見圖1,表3)。

圖1 Th17和Treg細胞流式分析圖Figure 1 Flow cytometry of Th17 and Treg cell

表3對照組與AS組Th17、Treg細胞比率測定結果

Table3RatioofTh17andTregcelldistributionbetweencontrolgroupandASgroup

組別nTh17細胞(%)Treg細胞(%) 對照組602.56±0.419.26±2.03 AS組645.37±0.825.11±0.94 t24.36214.447 P0.0000.000

2.3 Th17、Treg細胞相關細胞因子血清水平檢測結果

AS組IL-2、IL-6、IL-17、IL-23水平顯著高于對照組(P<0.05),IL-10和TGF-β與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表4)。

2.4 相關性分析

Pearson相關系數(shù)法分析顯示,AS患者外周血miR-155表達水平與Th17、IL-17正相關(r=0.779,P<0.01;r=0.854,P<0.01),與Treg、Foxp3負相關(r=-0.801,P<0.01;r=-0.871,P<0.01,見表5、圖2)。

表4Th17、Treg細胞相關細胞因子血清水平檢測結果(pg/ml)

Table4SerumlevelsofTh17andTregcell-relatedcytokines(pg/ml)

組別nIL-2IL-6IL-10IL-17IL-23TGF-β對照組6015.34±4.483.15±0.440.18±0.428.26±1.640.04±0.010.38±0.06AS組6428.29±5.156.05±0.970.19±0.4925.95±5.160.25±0.050.39±0.06 t14.965 21.662 0.122 26.064 32.9140.927 P0.0000.0000.9030.0000.0000.356

表5外周血miR-155水平與Th17、Treg細胞比率及IL-17、Foxp3表達的相關性分析

Table5CorrelationanalysisofperipheralbloodmiRNA-155levelwithTh17,TregcellratioandIL-17,Foxp3expression

因子miR-155rP Th170.7960.000 Treg-0.7540.000 IL-170.8240.000 Foxp3-0.8420.000

3 討論

AS屬自身免疫性疾病,發(fā)病早期無顯著臨床癥狀,不易被發(fā)現(xiàn),患者致殘率高,且病因較為復雜,與遺傳、環(huán)境、炎性細胞浸潤、細胞因子網(wǎng)絡平衡及微生物和宿主的相互作用等多方面因素相關。研究表明[5],位于人類21號染色體上的miR-155可參與機體炎癥免疫反應過程,調(diào)控T淋巴細胞增殖分化,促進炎性因子表達,導致免疫反應失調(diào)。陳倩云等[6]研究表明miR-155可抑制基質金屬蛋白酶分泌,刺激Th17細胞活化,促進自身抗體形成,參與自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展。Zhou等[7]通過研究發(fā)現(xiàn),miR-155在類風濕性關節(jié)炎患者外周單核細胞中高表達,表達水平是對照組的2倍左右。本研究結果顯示,AS患者外周血單個核細胞中miR-155相對表達量顯著高于對照組,提示miR-155在AS疾病患者外周血中高表達。

已有相關研究表明[8],CD4+T淋巴細胞功能異常、活性改變是影響AS疾病發(fā)展的重要因素。CD4+T細胞作為機體免疫應答的重要組成部分,可分為Th1、Th2、Th17、Treg等多個相互聯(lián)系和牽制的亞群,這些亞群可分泌細胞因子,形成細胞因子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)抗原特異性T淋巴細胞反應,調(diào)控免疫細胞表達。Th17細胞主要分泌炎癥細胞因子IL-17,IL-17是一種重要的炎癥介質,它可以激活免疫T細胞產(chǎn)生化學增活素、細胞黏附分子等,促進血管上皮細胞分泌炎癥因子,刺激單核細胞和成纖維細胞活化,聚集樹突狀細胞、中性粒細胞引起炎性浸潤,從而介導炎癥反應發(fā)生[9]。此外,Th17細胞還可以分泌IL-6、IL-22等細胞因子,在對外來細菌和真菌的免疫應答中活化中性白細胞,進一步介導炎癥反應。IL-17可以與IL-6、IL-1協(xié)同促進Th17細胞分泌炎性細胞因子,加快Th17細胞的分化。動物學試驗研究顯示[10],人為敲除或阻斷經(jīng)IL-17受體拮抗劑治療小鼠身上的IL-17后,小鼠軟骨組織受傷程度和關節(jié)炎癥嚴重程度得到極大改善。本研究結果顯示,AS組Th17細胞比率和IL-17顯著高于對照組,提示Th17細胞百分率和細胞因子IL-17在AS患者中高表達,二者相輔相成相互促進,共同參與AS疾病發(fā)生發(fā)展。

Treg細胞是CD4+T細胞亞群之一,具有免疫抑制作用,可通過分泌TGF-β、IL-10或細胞間接觸介導特異性免疫抑制的調(diào)控性T細胞,進而抑制效應T細胞增殖,控制免疫應答強度,維持機體外周免疫耐受性,減輕組織受傷程度[11]。細胞因子TGF-β、IL-2和Foxp3是影響Treg細胞分化的主要因素,Foxp3+Treg細胞可直接或間接抑制機體免疫應答[12],因此常以Foxp3作為Treg細胞的重要標志。本研究結果顯示,AS組Treg細胞比率和Foxp3表達水平顯著低于對照組,提示Treg細胞百分率和Foxp3在AS疾病患者體內(nèi)低表達。

圖2 miR-155水平與Th17、Treg、IL-17及Foxp3的相關性分析Figure 2 Correlation analysis of microRNA-155 levels with Th17, Treg, IL-17 and Foxp3

相關研究表明[13],Th17細胞與Treg細胞之間存在相互作用,正常機體中,Th17/Treg細胞處于平衡狀態(tài),共同參與免疫調(diào)節(jié),維持機體有效免疫應答。在自身免疫疾病患者體內(nèi),處于失衡狀態(tài),對免疫反應起負調(diào)控作用。一方面,Treg細胞通過下調(diào)IL-23和IL-17水平抑制Th17細胞分化,IL-23是由巨噬細胞或樹突狀細胞分泌的一種促炎癥細胞因子,可維持Th17細胞穩(wěn)態(tài)擴增產(chǎn)生IL-17,已經(jīng)過動物試驗研究證明與自身免疫疾病緊密相關[14]。任明亮等[15]通過對AS患者體內(nèi)Th17和IL-23分布狀態(tài)與水平研究表明,IL-23在AS疾病患者體內(nèi)高表達,且其受體易感性顯著增強。鄔秀娣等[16]研究表明,IL-23在AS患者CD4+T細胞上高表達,可促進患者外周血單個核細胞分泌IL-17。另一方面,TGF-β在低濃度和高濃度狀態(tài)下可分別誘導Th17和Treg細胞產(chǎn)生,其與IL-6或IL-21結合時,對Treg細胞分化起抑制作用。本研究結果顯示,AS患者外周血單個核細胞中Th17細胞顯著增多,Treg細胞顯著減少,Th17/Treg存在嚴重失衡現(xiàn)象,這與張立麗等[17]研究結果一致,提示Th17/Treg細胞失衡可能促進AS疾病的發(fā)展。Th17、Treg細胞相關細胞因子IL-2、IL-6、IL-17、IL-23均屬促炎因子,可分別通過不同機制誘導Th17細胞分化,導致機體組織損傷。本研究結果顯示,AS組IL-2、IL-6、IL-17、IL-23水平顯著高于對照組,推測IL-2、IL-6、IL-17、IL-23在AS患者血清中高表達。IL-10屬抑炎癥因子,可通過減緩抗原特異性T細胞繁殖來控制機體免疫反應,影響免疫適應性。IL-10可由Th2、Treg等細胞分泌,來源較為復雜,在本研究中,AS組和患者組中IL-10水平無顯著差異,推測其不能作為AS疾病評估指標。TGF-β是在控制炎癥因子活化過程中起作用的一種多效能細胞因子,可正向調(diào)節(jié)Treg細胞分化,維持機體免疫平衡,但當與IL-6共同存在時,可刺激Th17分化,負調(diào)節(jié)機體免疫反應[18]。本研究結果表明TGF-β在AS患者和對照組中無統(tǒng)計學差異,說明TGF-β對AS的參與機制尚需進一步研究。相關性分析結果顯示,AS患者外周血miR-155表達水平與Th17、IL-17正相關,與Treg、Foxp3負相關,提示miR-155可能通過影響Th17、Treg細胞水平,打亂Th17/Treg細胞平衡狀態(tài),參與AS疾病發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,AS患者外周血中miR-155和Th17細胞高表達,Treg細胞低表達,Th17/Treg細胞出現(xiàn)失衡現(xiàn)象,AS患者外周血miR-155表達水平與Th17細胞百分率正相關,與Treg細胞百分率負相關。推測AS患者外周血中miR-155表達水平可能影響Th17/Treg細胞平衡狀態(tài)。