劉云鵬，劉帛嶼，趙 陽，王麗敏

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 滄州 061100)

水霉病是出現(xiàn)在淡水養(yǎng)殖過程中的一種真菌性疾病。水霉菌感染體表受傷組織和死卵，在其表面形成一層灰白色棉絮狀覆蓋物，又叫水棉病或者覆霉病，還稱作白毛病或者膚霉病[1]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十幾種水霉病的病原，其中發(fā)病率最高的是水霉和綿霉。水霉病是目前一種很難治愈的疾病?，F(xiàn)在市場上出售的治療水霉病的藥物大部分是以化學(xué)藥物為主要成分，如福爾馬林、亞甲基藍(lán)、碘等。福爾馬林在病發(fā)的早、中、晚期都具有不錯的效果，但是其毒性較大，會對魚體造成一定程度的損傷，其他普通化學(xué)藥物只在早期具有一定效果，在中期及晚期效果甚微。與這些化學(xué)藥物相比，中草藥生長于自然環(huán)境，選用一些具有殺菌效果的中草藥進行配比制藥，具有副作用小、藥物殘留極低、藥物成本適中、藥效持續(xù)時間長等諸多優(yōu)點，有著廣泛的開發(fā)前景，實踐意義重大。

研究發(fā)現(xiàn)，中草藥成分復(fù)雜，活性成分種類繁多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)300多種中草藥對抑制真菌有效果。但是考慮到中草藥抑菌藥理復(fù)雜，可能有的中草藥單個使用效果不明顯，與其他藥物配合使用之后，又發(fā)揮出不同的藥效。大黃、苦參、五倍子三種中草藥中，含有較高的生物堿類、甙類和鞣酸等抑制真菌的有效成分，因此本實驗選擇這三種中草藥進行治療水霉病的試驗。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大黃500 g、五倍子500 g、苦參500 g、蒸餾水若干桶、新鮮馬鈴薯1 000 g、瓶裝瓊脂500 g、瓶裝葡萄糖500 g、水霉孢子一瓶。

1.2 試驗儀器

潔凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、離心機、抽濾機、電爐、高壓滅菌鍋、500 mL燒杯、1 L大燒杯、200 μL移液槍、10 mL圓底連蓋離心管、研缽、2 500 mL錐形瓶、冰箱、血球計數(shù)板、打孔器、布氏漏斗、電子天平等。

1.3 實驗方法

1.3.1 水霉培養(yǎng)基的制作 參考文冰的實驗[2]選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

選取新鮮馬鈴薯，稱量250 g，清洗干凈，去掉表皮，切成邊長為1 cm小碎方塊，放入大燒杯中加入蒸餾水至1 000 mL，加熱，小火煮沸持續(xù)30 min，制成馬鈴薯漿液，冷卻[3]，過濾。準(zhǔn)備1 000 mL錐形瓶，加入850 mL馬鈴薯汁、17 g濃度2%葡萄糖、17 g瓊脂，攪拌混勻，使其完全溶解，煮沸。冷卻，再次加熱，反復(fù)三次[4]。用脫脂棉將錐形瓶口封好，牛皮紙包裹，將培養(yǎng)液與實驗用具一并放入高壓滅菌鍋中滅菌，121 ℃，滅菌30 min[5]。取出滅菌后的培養(yǎng)基，稍冷卻，倒平板。待平板中的培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，移至25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置保存24 h，檢查培養(yǎng)基是否被雜菌污染[6]。將無污染培養(yǎng)基移至4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 選擇水霉孢子 取出水霉孢子，進行驗活及接種實驗。先將實驗用具紫外線殺菌20 min，再將孢子水和下層勻漿倒入平板，涂布，此步驟制作兩個接種培養(yǎng)基，便于對比觀察。將已接種好的菌落移至27 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4 d。若發(fā)現(xiàn)水霉菌長勢良好，則可以進行水霉孢子的分離。輕輕刮下培養(yǎng)基上的水霉孢子和水霉菌絲，加入少許蒸餾水一同放入研缽中充分研磨[7]。將研磨好的水霉孢子勻漿倒入離心管中，離心，2 200 rmp，10 min。取適量上清液，使用血球計數(shù)板計算水霉孢子數(shù)。再使水霉孢子和水霉菌絲同上清液混合，用100目篩絹充分反復(fù)過濾，使用生物顯微鏡觀察濾液中水霉孢子數(shù)，計算出孢子濃度為4×105cuf/mL，孢子數(shù)符合要求，可以繼續(xù)實驗(當(dāng)水霉孢子數(shù)在3×105～5×105cuf/mL時即可以使用)[8]。

1.3.3 中草藥藥物混合 用電子天平稱取大黃、苦參、五倍子各5 g，分別放入500 mL燒杯中，按照中草藥和水1∶70的比例[9]，分別加入蒸餾水350 mL，用紗布蓋上燒杯口浸泡24 h，加熱，待水沸騰后，小火熬制45 min，期間不停止攪拌。用紗布將藥液濾出，之后抽濾，再加熱濃縮，直至剩余20 mL，此時藥液濃度為2.5 mg/mL。稀釋原藥液至濃度為1.0、0.5、0.3 mg/mL。此時制作出的每種藥液分別有1.0、0.5、0.3 mg/mL三種濃度。將藥液進行消毒滅菌。

以一種中草藥為變量，另外兩種中草藥保持0.5 mg/mL的濃度且恒定，將作為變量的中草藥設(shè)置出三個濃度梯度，如此配成組合(見表1)，分別標(biāo)記出序號。實驗時全部設(shè)置三組平行實驗。

1.3.4 培養(yǎng)水霉孢子 首先，用移液槍吸取750 μL水霉孢子液，在培養(yǎng)基上涂布；再用孔徑為0.6 mm打孔器在培養(yǎng)基上均勻打三個孔[10]，進行三組平行實驗。分別用標(biāo)簽紙標(biāo)記好實驗序號I至IX，貼在培養(yǎng)基的底部。最后，用移液槍按照表1進行藥液注入，吸取三種藥液各50 μL注射到同一小孔內(nèi)，三個孔打入相同種類、相同劑量的藥液。將培養(yǎng)基移至24 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)2～4 d，記下數(shù)據(jù)。

表1 三種中草藥的不同配比方案(mg/mL)

最后對篩選出的藥物進行驗證分析。原理如下：三種不同濃度中草藥的配比試驗結(jié)果記錄之后，只能證明三種中草藥的各自使用濃度效果，不能表現(xiàn)出最佳的配比組合，將各自最佳濃度進行單方實驗和混合實驗之后，通過對比，確定出實驗結(jié)果，進行生產(chǎn)試驗。

2 實驗結(jié)果

實驗結(jié)果見表2-表5。

表2 大黃抑菌圈結(jié)果(mm)

表3 苦參抑菌圈結(jié)果(mm)

表4 五倍子抑菌圈結(jié)果(mm)

表5 三種中草藥不同配比的抑菌圈結(jié)果(mm)

分別將0.3 mg/mL大黃、1 mg/mL苦參、1 mg/mL五倍子進行單方抑菌試驗[11]。取制作好的培養(yǎng)基，吸取750 μL的水霉孢子液接種，涂布，接著用打孔器在培養(yǎng)基上均勻打三個孔[12]，分別吸取150 μL 0.3 mg/mL大黃藥液注入到小孔中，設(shè)置三個平行實驗組?？鄥ⅰ⑽灞蹲訉嶒灧纸M同理。再分別取0.3 mg/mL大黃+1 mg/mL苦參+1 mg/mL五倍子(藥物含量)各1 mL進行混合(記為組合X)，做抑菌試驗，設(shè)置三個平行實驗組，操作方法同上所述，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d。記錄結(jié)果(見表6)。

表6 三種中草藥在各自最佳濃度下

3 分析與討論

根據(jù)表2、3、4數(shù)據(jù)分析，三種中草藥在不同濃度下，抑菌效果也不同，存在較大差異。

根據(jù)表2可知，大黃在濃度為1.0 mg/mL時，抑菌圈大小分別為7.5、7.0和5.5 mm，基本無抑菌效果；在濃度為0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的情況下，兩個試驗起到較好的抑菌作用；尤其在濃度為0.3 mg/mL時，抑菌圈直徑平均數(shù)據(jù)為14 mm，可以看出，在設(shè)置的濃度梯度中0.3 mg/mL抑菌能力最強。

根據(jù)表3可知，苦參的濃度為0.3 mg/mL時，數(shù)據(jù)為7.5、7.5和14.0 mm，抑菌程度較輕；在濃度為0.5 mg/mL時，記錄結(jié)果是19.0、17.0和16.5 mm，平均值是17.5 mm，參考孔徑大小，有一定抑菌作用；當(dāng)苦參濃度為1.0 mg/mL時，對水霉孢子的抑菌效果最好，平均值是19.5 mm，結(jié)果表明，苦參的濃度與抑菌效果成正相關(guān)。

根據(jù)表4可知，五倍子濃度為1 mg/mL時，抑菌圈平均直徑為18 mm，三組均表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；五倍子濃度為0.5 mg/mL時，抑菌圈直徑為12.2 mm，有一定的抑菌效果；五倍子濃度為0.3 mg/mL時，抑菌圈大小為12.0 mm，三個濃度組全部表現(xiàn)出抑菌效果，表明五倍子濃度與抑菌效果呈正比。在三種濃度下均有抑菌效果，濃度為1 mg/mL時作用最強，最大抑菌圈為20 mm，平均抑菌圈為18 mm。

三種藥物的用量和效果之間的關(guān)系各有不同，在本試驗設(shè)置的濃度梯度范圍內(nèi)顯示，有的抑菌圈和藥物濃度成正相關(guān)，中草藥液的濃度高，對水霉菌抑制作用就好，如五倍子和苦參，其中五倍子的三種濃度均有抑菌效果；也有的藥液濃度與抑菌效果成負(fù)相關(guān)，如大黃，當(dāng)大黃濃度為0.3 mg/mL時抑菌效果是最好的。結(jié)合以上分析并根據(jù)表5數(shù)據(jù)總結(jié)出，當(dāng)大黃濃度為0.3 mg/mL、苦參濃度為1.0 mg/mL、五倍子濃度為1.0 mg/mL時，抑菌效果最好。

由表6可知，在三種中草藥單個濃度進行實驗時，1.0 mg/mL苦參和0.3 mg/mL大黃的抑菌圈分別為5.5和6.5 mm，抑菌圈均較小，幾乎沒有抑菌效果，1.0 mg/mL五倍子抑菌圈為17.0 mm，抑菌效果明顯，組合X的抑菌圈大小為19.5 mm，抑菌效果最為明顯。

通過對比發(fā)現(xiàn)，在單方中草藥中，大黃、苦參幾乎沒有抑菌效果，單方五倍子對水霉孢子有一定的抑菌效果，但是單方五倍子抑菌圈小于三種中草藥復(fù)方的抑菌圈。在10組不同配比試驗中，對比發(fā)現(xiàn)，組合IV(苦參1 mg/mL+大黃0.5 mg/mL+五倍子0.5 mg/mL)中，最大抑菌圈直徑為20 mm，平均抑菌圈直徑為19.5 mm，對水霉菌的抑制效果最好。在組合X(苦參1 mg/mL+大黃0.3 mg/mL+五倍子0.3 mg/mL)中，抑菌圈直徑為19.5 mm，經(jīng)過數(shù)據(jù)查驗，可以判定兩者在治療效果方面基本一致。

4 結(jié)論

通過正實驗和驗證試驗表明，配比組合比單方的抑菌效果要好。在10組不同的組合中，組合IV和組合X對水霉孢子的抑菌效果均比較好，但是組合X在藥量使用上低于組合IV，可以節(jié)約成本，降低藥液對魚類的傷害和刺激，因此結(jié)合實際情況考慮，組合X的配方更適于實際生產(chǎn)。

中草藥治療水霉病具有諸多優(yōu)勢，其不僅可以殺菌抑菌，還能夠調(diào)節(jié)水體環(huán)境，提高水產(chǎn)動物的免疫力。此外，人們越來越關(guān)注水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題，中草藥以其藥物殘留低，成本低，效果好的優(yōu)勢，將會在未來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮越來越大的作用。本實驗選擇三種中草藥進行配比研究，選擇出最佳配方，希望能夠在水霉病防治上發(fā)揮一定的作用。