王建華，張俊哲，趙 丹，王玉玲，肖 妍

（天津海關(guān)，天津 300456）

赤羽病是危害牛、羊等反芻動(dòng)物繁殖性能的重要蟲媒疫病，以流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎，以及胎兒畸形，新生胎兒發(fā)生關(guān)節(jié)彎曲積水性無腦綜合癥（簡(jiǎn)稱AH綜合征）為特征，主要流行于澳大利亞以及東南亞、東亞、中東和非洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-4]，給流行地區(qū)的牛、羊養(yǎng)殖業(yè)造成一定經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)90年代以來，我國(guó)上海和新疆等地也有本病的報(bào)道[5-6]，因此該病對(duì)我國(guó)牛、羊養(yǎng)殖業(yè)的威脅不容忽視。在分類上，赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）屬于布尼病毒科（Buny aviridae）布尼病毒屬（Orthobunyavirus）辛布（Simbu）病毒血清群成員，為單股負(fù)鏈RNA 病毒。AKAV基因組由大（L）、中（M）、?。⊿）3個(gè)RNA 片段構(gòu)成，其中M RNA 編碼1個(gè)由1 401個(gè)氨基酸組成的M蛋白前體。該前體進(jìn)一步裂解為Gn和Gc囊膜糖蛋白和1個(gè)非結(jié)構(gòu)Nsm蛋白[7-8]。研究證實(shí)，G1蛋白為AKAV的一種由936個(gè)氨基酸殘基組成的囊膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為120 kD，存在多個(gè)抗原表位區(qū)。該蛋白不僅參與病毒粒子對(duì)宿主細(xì)胞的侵入、裝配和成熟過程，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[9-10]，在赤羽病診斷試劑和疫苗研制方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。為此，本研究對(duì)Gc405aa—480aa肽段編碼序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了Gc405aa—480aa肽段的高效可溶性表達(dá)，并對(duì)該重組肽段進(jìn)行了純化和抗原性鑒定，以期為后續(xù)開展Gc蛋白單克隆抗體制備、B細(xì)胞表位鑒定和診斷試劑研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、參考血清和主要試劑

宿主菌E.coli. BL21（DE3）、山羊抗AKAV陽性血清：由天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心反芻動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存；HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗：購自JACKSON 公司；氨芐青霉素、IPTG和Ni-NTA Agarose：購置于GIAGEN公司；BugBuster?Master Mix和 Immobilon-PSQPVDF膜：購自MERCK公司；QuickblokTM封閉液、洗滌液和DAB顯色試劑盒：購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 Gc405aa—480aa肽段抗原表位區(qū)預(yù)測(cè)及原核表達(dá)載體構(gòu)建

使用IEDB 數(shù)據(jù)庫（Immune epitope database）中的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0軟件，對(duì)AKAV KM-1/Br/06毒株M基因編碼的Gc蛋白（GenBank：BAG54921.1）線性抗原表位進(jìn)行在線分析，對(duì)Gc蛋白的1個(gè)75氨基酸肽段（405aa—480aa）的編碼序列，送由上海捷瑞生物技術(shù)公司經(jīng)密碼子優(yōu)化后進(jìn)行人工合成，通過BamHI/SalI位點(diǎn)，連接到原核表達(dá)載體PET-32a，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET-Gc405aa—480aa，再通過測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證表達(dá)序列是否正確。

1.3 重組rHis-Gc405aa—480aa肽段的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)載體PET-Gc405aa—480aa轉(zhuǎn)化的E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按1%接種量接種于新鮮LB培養(yǎng)基中。當(dāng)菌液OD600約為0.5時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，在28 ℃、200 r/min振搖條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h，離心收集菌體；按5 mL/g比例，將濕菌加入細(xì)菌裂解液BugBuster?Master Mix，混勻，作用10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min；分別收集菌體裂解液、上清和沉淀，加入等量2×Loading Buffer，沸水水浴5 min；按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE，分析重組肽段的表達(dá)情況。

1.4 重組rHis-Gc405aa—480aa肽段的大量表達(dá)及純化

將1 L新鮮LB培養(yǎng)液，按1.3條件誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌后，6 000 r/min 離心5 min，收集菌體；用0.1 mol/L、pH7.5 的PBS液洗滌菌體1次，6 000 r/min 離心5 min，收集菌體；按5 mL/g，將濕菌加入細(xì)菌裂解液BugBuster?Master Mix，混勻，冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，然后收集裂解液上清。將裂解液上清移入裝有Ni+-NTA樹脂的重力柱，在冰浴條件下結(jié)合1 h；依次用20、60和80 mmol/L咪唑濃度的洗滌液各洗滌2次，每次10 min，最后用300 mmol/L咪唑濃度的洗脫液洗脫。將洗脫液裝入透析袋中，用透析液（pH8.0、50 mmol/L 的 Tris-HCl）4 ℃透析過夜，收集的透析液即為純化的重組rHis-Gc405aa—480aa肽段。用IMPLEN超微量分光光度計(jì)，測(cè)定重組rHis-Gc405aa—480aa肽段濃度，再用SDSPAGE分析純化后的重組肽段純度。

1.5 重組rHis-Gc405aa—480aa肽段的抗原性鑒定

將 純 化 的 重 組 rHis-Gc405aa—480aa肽 段， 經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用QuickblokTM封閉液封閉過夜；用洗滌液洗滌3次后，加入1:50稀釋的山羊抗AKAV陽性血清，37 ℃ 孵育1 h，再用洗滌液洗滌3次，每次5 min；加入1:5 000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗山羊二抗IgG，37 ℃ 孵育1 h，用洗滌液洗滌3次，每次5 min；使用DAB試劑盒顯色，拍照。

2 結(jié)果

2.1 Gc405aa—480aa肽段預(yù)測(cè)及重組表達(dá)載體構(gòu)建

使用IEDB 數(shù)據(jù)庫對(duì)AKAV Gc蛋白（GenBank：BAG54921.1）進(jìn)行在線預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)1個(gè)由75氨基酸組成肽段（405aa—480aa）的抗原性及親水性，結(jié)果見圖1。在圖1-A中，縱坐標(biāo)數(shù)值代表對(duì)應(yīng)橫坐標(biāo)位置的氨基酸抗原性數(shù)值，以0.5為閾值，數(shù)值越高表示該置的氨基酸抗原性越強(qiáng)，黃色區(qū)域?yàn)樵撾亩晤A(yù)測(cè)存在抗原表位的區(qū)域。圖1-B為該肽段親水性預(yù)測(cè)結(jié)果，其中黃色區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，綠色區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū)。對(duì)Gc405aa—480aa肽段的編碼序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后進(jìn)行DNA片段合成，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET-Gc405aa—480aa，經(jīng)測(cè)序證實(shí)該DNA合成片段的堿基序列及編碼的氨基酸序列完全正確（圖2）。

圖1 Gc405aa—480aa肽段的抗原性和親水性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 人工合成的DNA序列及編碼的氨基酸序列

2.2 重組Gc405aa-480aa肽段的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

SDS-PAGE顯 示， 在28℃、0.1 mmol/L的IPTG中誘導(dǎo)8 h后，PET-Gc405aa—480aa重組菌的裂解液在26 kD處出現(xiàn)1條蛋白條帶，與預(yù)期重組肽段蛋白分子質(zhì)量一致，而未誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌裂解液中缺失此蛋白條帶，凝膠圖像分析表明該重組肽段的表達(dá)量占菌體總蛋白的50%（圖3）。進(jìn)一步分析顯示，重組Gc405aa—480aa肽段完全存在于誘導(dǎo)表達(dá)菌的裂解液上清中，表明該重組肽段完全以可溶性形式表達(dá)。對(duì)含有重組Gc405aa—480aa肽段的上清液用Ni+-NTA樹脂進(jìn)行親和層析純化，依次用60、80 mmoL/L咪唑濃度的洗滌液洗滌，發(fā)現(xiàn)取得的純化效果最好，純化后的重組Gc405aa—480aa肽段純度為94%，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL（圖3）。

圖3 重組Gc405aa—480aa肽段的表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析

2.3 重組Gc405aa—480aa肽段的Western blot鑒定

以山羊抗AKAV陽性血清，對(duì)純化的重組Gc405aa—480aa肽段進(jìn)行Western blotting分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在26 kD處出現(xiàn)1條清晰的特異性反應(yīng)條帶（圖4），表明該重組肽段可被山羊抗AKAV陽性血清識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。

3 討論

赤羽病是危害牛、羊等反芻動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能的重要疫病，而高質(zhì)量診斷試劑可為赤羽病的診斷、檢疫和防控工作提供技術(shù)支撐。眾所周知，診斷抗原的抗原性和純度是制約ELISA方法敏感性和特異性的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，辛布病毒群的S基因節(jié)段序列同源性很高，其編碼的N蛋白是群特異性抗原[11]。因此，無論是使用AKAV全病毒抗原，還是使用重組N蛋白抗原建立的ELISA檢測(cè)方法，均存在與同群其他病毒感染抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的不足。然而，辛布病毒群M基因節(jié)段的序列變異性較大，其編碼Gc蛋白的氨基酸序列同源性僅為33.1%～47.3%，而Gc蛋白在AKAV各分離株之間的同源性卻很高[12-14]，這提示選用Gc蛋白為檢測(cè)抗原可能是提高AKAV血清抗體ELISA檢測(cè)方法特異性的有效途徑。

圖4 重組Gc405aa—480aa肽段的Western blot分析

利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白具有表達(dá)量高、生產(chǎn)周期短和成本低的優(yōu)點(diǎn)，但用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)大分子質(zhì)量的GC蛋白比較困難，需要對(duì)多個(gè)GC蛋白的強(qiáng)抗原區(qū)進(jìn)行截短篩選表達(dá)及抗原性鑒定。目前國(guó)內(nèi)僅有徐樹蘭等[15]對(duì)Gc蛋白156aa—476aa區(qū)域進(jìn)行了截短表達(dá)及抗原性鑒定，但該重組蛋白是以包涵體形式表達(dá)的。本研究對(duì)Gc405aa—480aa肽段編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體PETGc405aa—480aa，實(shí)現(xiàn)了重組 rHis-Gc405aa—480aa肽段在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)。在純化重組rHis-Gc405aa—480aa肽段的方法上，本研究采用細(xì)菌裂解液BugBuster?Master Mix替代超聲波破碎菌體，因而減少了對(duì)目的蛋白的損傷；通過對(duì)洗滌液最適咪唑濃度的確定，獲得了大量高純度的重組rHis-Gc405aa—480aa肽段。Western blotting顯示，重組rHis-Gc405aa—480aa肽段對(duì)AKAV陽性血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)原性，表明該重組肽段在AKAV單克隆抗體制備、B細(xì)胞表位鑒定以及血清抗體ELISA檢測(cè)試劑盒研發(fā)方面具有良好的應(yīng)用前景。