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(1.山西省中醫(yī)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030013)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，全球每年新確診病例約93.4萬人，位居所有惡性腫瘤的第二位[1]。慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)伴癌前病變則大大增加胃癌的發(fā)病率，因此延緩和阻止甚至逆轉(zhuǎn)癌前病變的病理性進(jìn)程能夠有效預(yù)防胃癌的發(fā)生。

目前西醫(yī)缺乏治療慢性萎縮性胃炎伴癌前病變(腸化生和異型增生)的有效方法，治療多以緩解癥狀為主，還沒有行之有效的阻斷和逆轉(zhuǎn)該病的西藥。中醫(yī)藥治療胃癌前病變具有一定的優(yōu)勢[2]。本課題組2007～2012年先后兩次運(yùn)用珍珠舌草膠囊對CAG伴癌前病變進(jìn)行臨床研究[3,4]，經(jīng)臨床反復(fù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在改善慢性萎縮性胃炎臨床癥狀，降低胃黏膜慢性炎癥、Hp感染等方面作用顯著。甚至還可以逆轉(zhuǎn)腸化生和異型增生。

珍珠舌草膠囊全方中枳實(shí)、莪術(shù)和蒲公英等富含揮發(fā)油[5-7]。研究證實(shí)，多種揮發(fā)油具有抗腫瘤作用[6,7]，本研究旨在觀察珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對AGS細(xì)胞增殖和凋亡的作用并對其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

AGS細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；Ham’s/F-12 培養(yǎng)液購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)購于杭州四季青生物工程有限公司；DMSO(二甲基亞楓)和RNase A(核糖核酸酶A)購于金科宏達(dá)生物公司；MTT購于上海日初生物科技有限公司；PI(Propidium iodide,碘化丙啶)購于美國Sigma公司；胰酶購于美國Invitrogen公司；33342/PI 試劑盒購于中國Beyotime公司；Annexin V購于美國BioVision公司；各種規(guī)格培養(yǎng)板購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；SpectraMAX 190 微孔讀板機(jī)購于美國分子儀器公司(MD，USA)；FACScan 流式細(xì)胞儀購于美國BD公司(Becton Dickinson，USA)；ModFitLT V3.0軟件和熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 原藥材

珍珠舌草膠囊中黃芪、枳實(shí)、白術(shù)、木香、砂仁、丹參、莪術(shù)、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等藥材購于山西國新晉藥集團(tuán)有限公司。

1.3 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油的提取

依據(jù)2010版中國藥典附錄VD揮發(fā)油測定法甲法提取，首先將珍珠舌草膠囊方一帖粉碎成粗粉轉(zhuǎn)移至1 000 mL原底燒瓶，加入8倍量水浸泡 5 h左右，加入沸石，連接揮發(fā)油提取器，檢查氣密性后武火煮沸，改成文火保持微沸約8h至不再有揮發(fā)油提出后，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端達(dá)到刻度0線上面5 mm處為止，放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發(fā)油量，存放于密閉棕色玻璃瓶中待用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的Ham’s/F 12 培養(yǎng)液，置于37°C、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞活力的檢測

細(xì)胞存活率檢測 AGS細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，接種密度為1.0×104個(gè)細(xì)胞/mL，每孔接種200 μL，使其貼壁過夜。采用信封法分組，給予不同濃度(0、40、80、160μg/mL)的珍珠舌草膠囊揮發(fā)油干預(yù)AGS細(xì)胞的生長(n≥6)，孵育12 h和24 h后，加入20 μL的MTT，接著孵育4 h，棄培養(yǎng)基和MTT，加入150 μL的DMSO(二甲基亞砜，dimethy sufoxide)，振蕩混勻15 min，570 nm處OD值用SpectraMAX 190微孔讀板機(jī)檢測，生長抑制率按[1-(用藥組OD值 /未用藥組OD值) ]× 100 %計(jì)算。

1.6 細(xì)胞周期的檢測

AGS細(xì)胞以2×104個(gè)/mL濃度接種在6孔培養(yǎng)板中，過夜待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成不含血清的培養(yǎng)基，饑餓以同步，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，換上含有藥物和不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，含藥物濃度為40、80、160μg/mL,細(xì)胞孵育12、24 h，按細(xì)胞周期檢測步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。作用時(shí)間到達(dá)后用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，用冷PBS終止消化，吹打細(xì)胞，移入離心管中。棄上清，冷PBS洗兩次。離心去PBS，加入1mL PBS重懸細(xì)胞，吹入冰預(yù)冷的無水乙醇固定，4℃，6h以上。1 000 rpm離心5 min棄去固定液，2 mL冷PBS洗兩次，離心后棄上清。4℃用PI染液染色，避光孵育30min。流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

AGS細(xì)胞以2.5×104個(gè)/mL密度接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔3 mL，貼壁24 h后，將培養(yǎng)液換成不含血清的培養(yǎng)基，饑餓以同步，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，換上含有藥物和不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，珍珠舌草膠囊揮發(fā)油濃度為40、80、160μg/mL，允許細(xì)胞生長12、24 h，作用時(shí)間到達(dá)后從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，收集細(xì)胞上清，加0.125%胰酶消化細(xì)胞，37 ℃約1 min，加含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶的作用，輕柔吹打細(xì)胞，并收集細(xì)胞與上清一起，切忌損傷細(xì)胞。冰冷PBS(4 mL)中離心(300 g，5 min)，棄上清，旋渦振蕩器點(diǎn)動分散細(xì)胞后，加入4 mL Annexin V結(jié)合緩沖液再次洗滌細(xì)胞一次后完全棄上清。將細(xì)胞分散后加入500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入FITC標(biāo)記的Annexin V 1μL(終濃度1μg/mL)，再次點(diǎn)動混勻，隨后冰浴30 min，中間取出再混勻1次。30 min后，加入4 mL Annexin V結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，棄上清后，點(diǎn)動分散細(xì)胞，加入500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，置于冰浴中保存。上機(jī)前加入PI(終濃度5μg/mL)，并立即上機(jī)檢測。

1.8 Caspase 3活性檢測

AGS細(xì)胞以2.5×104個(gè)/mL密度接種在6孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，換上含有藥物和不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，含有藥物培養(yǎng)液濃度40、80μg /mL，允許細(xì)胞生長12、24 h，0.25%胰酶消化，細(xì)胞數(shù)需達(dá)到(1～5)×106個(gè)，離心1 500 rpm 5 min，懸浮細(xì)胞于50μL冰冷細(xì)胞裂解液10 min，10 000 g離心1 min，收集上清，冰上放置，然后進(jìn)行蛋白濃度測定，將50～200μg蛋白用細(xì)胞裂解液補(bǔ)充至50 μL，加入50μL的2×反應(yīng)緩沖液(含10 mM DTT)，加入5 μL的4 mM的DEVD-pNA(200μM終濃度)，37 °C孵育1～2 h，在酶標(biāo)儀405 nm處測定吸光值(OD)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對胃癌細(xì)胞活力的影響

40～160μg /mL的全方揮發(fā)油干預(yù)細(xì)胞12 h，可使AGS細(xì)胞活力從92.40%下降到19.60%；干預(yù)細(xì)胞24 h，可使AGS細(xì)胞活力從72.60%下降到6.10%，呈良好的濃度和時(shí)間依賴性。見表1(12 h組間比較，F(xiàn)=2 549.15；24 h組間比較，F(xiàn)=8 189.36，P<0.05)。

表1 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對AGS細(xì)胞活力的影響 %

注：1)與同組比較，P<0.05

2.2 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對細(xì)胞周期的影響

珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油干預(yù)胃癌細(xì)胞12 h能阻滯細(xì)胞于G2/M期，提示其能抑制胃癌細(xì)胞的分裂，從而阻止胃癌細(xì)胞的增殖，12 h從17.47%上升至32.53%，表明珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油干預(yù)胃癌細(xì)胞AGS細(xì)胞能阻滯胃癌細(xì)胞周期于G2/M期。見圖1(組間比較，F(xiàn)=182.57，P<0.05)。

圖1 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對胃癌細(xì)胞周期的影響(12 h)Figure1 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Cell Cycle ofGastric Cancer(12 h)

圖1A Control組細(xì)胞周期圖示
圖1B 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油40μg /mL組細(xì)胞周期圖示
圖1C 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油80μg /mL組細(xì)胞周期圖示
圖1D 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油160μg /mL組細(xì)胞周期圖示
圖1E 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對細(xì)胞周期的影響

珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油干預(yù)胃癌細(xì)胞24 h能阻滯細(xì)胞于G2/M期，從19.07%上升至38.79%，表明珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞能阻滯胃癌細(xì)胞周期于G2/M期。見圖2(組間比較，F(xiàn)=705.68，P<0.05)。

2.3 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油0 μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL、160μg/mL干預(yù)胃癌細(xì)胞12 h后，早期凋亡率分別為5.30%、10.50%、13.60%、17.60%，見圖3(組間比較，F(xiàn)=242.8，*P<0.05, **P<0.01)。干預(yù)24 h后，早期凋亡率分別為7.60%、11.30%、18.20%、25.00%，見圖4(組間比較，F(xiàn)=3 050.53，*P<0.05, **P<0.01)，具有時(shí)間和濃度的依賴性。

2.4 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對Caspase 3活性檢測的影響

珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油干預(yù)AGS細(xì)胞12 h，40μg /mL組和80μg /mL組Caspase 3的活性分別是對照組的1.90倍和4.31倍，見表2(組間比較，F(xiàn)=282 807.00，P<0.05)。干預(yù)24 h后，則是對照組的3.19倍和8.74倍，見表2(組間比較，F(xiàn)=15 081 762.2，P<0.05)。提示全方揮發(fā)油能呈時(shí)間和濃度依賴性地增加Caspase 3的活性，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對胃癌細(xì)胞周期的影響(24 h)Figure2 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Cell Cycle ofGastric Cancer(24 h)

圖2A Control組細(xì)胞周期圖示
圖2B 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油40μg /mL組細(xì)胞周期圖示
圖2C 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油80μg /mL組細(xì)胞周期圖示
圖2D 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油160μg /mL組細(xì)胞周期圖示
圖2E 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對細(xì)胞周期的影響

圖3 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對胃癌細(xì)胞凋亡的影響(12 h)Figure3 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Apoptosis ofGastric Cancer Cells(12 h)

圖3A Control組細(xì)胞凋亡圖示
圖3B 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油40μg /mL組細(xì)胞凋亡圖示
圖3C 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油80μg /mL組細(xì)胞凋亡圖示
圖3D 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油160μg /mL組細(xì)胞凋亡圖示
圖3E 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對細(xì)胞凋亡的影響

圖4 珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油對胃癌細(xì)胞凋亡的影響(24 h)Figure4 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Apoptosis ofGastric Cancer Cells(24 h)

表2 珍珠舌草膠囊揮發(fā)油對Caspase3活性的影響 %

3 討論

珍珠舌草膠囊由黃芪、枳實(shí)、白術(shù)、木香、砂仁、丹參、莪術(shù)、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等組成。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油能很好地抑制胃癌AGS細(xì)胞生長，阻滯細(xì)胞于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖與凋亡的平衡對于保持胃腸黏膜的完整性具有重要意義[8，9]。一旦這種平衡被破壞，就會誘發(fā)慢性萎縮性胃炎或胃癌前病變甚至是腫瘤的發(fā)生[9，10]。腸化生和異型增生打破了正常胃黏膜細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，增加了胃癌發(fā)生的機(jī)率，周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡是抑制細(xì)胞生長的兩個(gè)重要的因素。本研究證實(shí)珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油能顯著抑制AGS細(xì)胞的生長，可能與其阻滯細(xì)胞于G2/M期并促進(jìn)AGS凋亡有關(guān)。Caspase 3是這兩條途徑的一個(gè)主要環(huán)節(jié)，珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油能顯著增強(qiáng)Caspase 3的活性，其干預(yù)AGS細(xì)胞12 h，40 μg /mL組和80 μg /mL組Caspase 3的活性分別是對照組的1.90倍和4.31倍，干預(yù)18 h后，則是對照組的3.19倍和8.74倍。提示全方揮發(fā)油能呈時(shí)間和濃度依賴性地增加Caspase 3的活性。珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油能顯著促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡，可能與其增強(qiáng)Caspase 3的活性有關(guān)。

研究表明，白術(shù)中含有蒼術(shù)醇、蒼術(shù)酮、萜烯類化合物具有抑菌、抗腫瘤的作用[6]，枳實(shí)中檸檬烯具有抗炎作用[5]，莪術(shù)中的莪術(shù)油也具有抗腫瘤的作用[6]，蒲公英和白花蛇舌草都含有亞麻酸，具有抗炎[7]、抗腫瘤[11]的作用，黃芪中黃酮類具有顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[12]，木香中萜類具有抗炎、抗腫瘤和抗?jié)兊淖饔肹13]。砂仁中揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛和止瀉的功效[14]，丹參中桃拓酚具有很強(qiáng)的抑菌以及抗氧化作用[15]。珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油中許多有效成分具有抗炎、抗?jié)?、抑菌、調(diào)節(jié)胃腸道微循環(huán)、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。這可能是珍珠舌草膠囊治療CAG伴癌前病變甚至是消化系統(tǒng)腫瘤的有效成分。

綜上所述，珍珠舌草膠囊全方揮發(fā)油具有較好的抑制細(xì)胞生長的作用，此作用可能與其阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，促凋亡作用可能通過Caspase 3的活性增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)，該結(jié)果為珍珠舌草膠囊抗腫瘤研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。