基于標(biāo)準(zhǔn)菌株Vd076的棉花黃萎病抗性快速分子評(píng)價(jià)方法初報(bào)

趙麗紅，馮自力，馮鴻杰，師勇強(qiáng)，周京龍，張冉，魏鋒，朱荷琴

（國(guó)家棉花生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000）

黃萎?。╒erticillium wilt）嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，是比較難防治的維管束病害[1-2]。 該病發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)，化學(xué)防治和生物防治難度大[3-4]。目前，種植抗病品種是控制其危害的最經(jīng)濟(jì)有效的措施[5-6]。

棉花品種抗黃萎病性鑒定方法分為成株期鑒定和苗期鑒定法。 由于棉花黃萎病是成株期病害，發(fā)生危害期為棉花的現(xiàn)蕾初期到收獲期，且不同品種對(duì)黃萎病的抗性與生育期相關(guān)，采用成株期鑒定更能真實(shí)檢測(cè)棉花品種的抗黃萎病性。 目前，成株期鑒定一般采用重病田或人工病圃，重病田鑒定由于不能控制病原菌的數(shù)量、 發(fā)病不均勻等問(wèn)題，只能用于育種材料的初篩，而人工病圃成株期鑒定是確定棉花黃萎病抗性的最可靠方法，并于2009年發(fā)布實(shí)施了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22101.5—2009。苗期鑒定主要是通過(guò)菌液澆根[7]、蘸根[8]、針刺[9]等方法接菌，與成株期鑒定相比，大大縮短了鑒定周期，且比較容易掌握、 重復(fù)性也較好，但也存在以下不足：（1）反映的是苗期的抗病性，且人為傷根，很難達(dá)到對(duì)品種抗病性綜合評(píng)價(jià)的目的；（2） 需要嚴(yán)格的環(huán)境條件，且技術(shù)環(huán)節(jié)不易掌握，如：控制適宜的溫濕度、抗病和感病對(duì)照、接種時(shí)期、接種濃度和接種量、調(diào)查時(shí)期等；（3）耗費(fèi)人力和物力，鑒定周期偏長(zhǎng)，如：需要對(duì)土壤或基質(zhì)進(jìn)行滅菌、制作營(yíng)養(yǎng)缽、培養(yǎng)病原菌等，仍需40 d 左右的鑒定周期。 鑒于棉花黃萎病發(fā)病周期長(zhǎng)，在成株期和苗期鑒定棉花黃萎病抗性耗時(shí)較長(zhǎng)，受環(huán)境影響大，為了滿足研究者的不同需求，有必要摸索棉花黃萎病抗性快速鑒定的新方法。 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR） 技術(shù)鑒定植物抗病性已有諸多應(yīng)用，如苜蓿[10]、甘蔗宿根矮化病菌[11]、普通菜豆[12]等，很多研究結(jié)果已經(jīng)證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)能夠有效地區(qū)分抗病性水平不同的寄主植物，并不用單純通過(guò)植株外部病癥嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)[13-15]。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)大麗輪枝菌 （Vd076） 在棉苗根部DNA的含量，然后分析其與寄主抗黃萎病性的關(guān)系，旨在建立一種更加快速的棉花黃萎病抗性鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 供試棉花品種

選取28 個(gè)黃萎病抗性不同的陸地棉品種，分別為冀棉11、創(chuàng)0712、冀棉169、中棉所49、新植5號(hào)、中植棉2 號(hào)、新陸早41 號(hào)、新陸中47 號(hào)、魯棉研28、中棉所50、冀棉958、瑞雜816、中棉所41、魯棉研21、中棉所63、銀瑞361、銀科178、嘉興5388、周棉9408、百棉1 號(hào)、H559、中棉所8 號(hào)、中棉所35、新陸早42 號(hào)、鄂雜棉29、湘雜棉7 號(hào)、新陸早7 號(hào)、銅雜411 F1。 其中，中植棉2 號(hào)為抗病對(duì)照，冀棉11 為感病對(duì)照。 供試品種均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 供試菌株

供試菌株為人工病圃棉花黃萎病抗性評(píng)價(jià)采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株Vd076（CGMCC No.5902）[16]，由本實(shí)驗(yàn)室保存。 于2007年分離自河南省內(nèi)黃縣棉花黃萎病重病田，為致病力中等偏強(qiáng)、落葉型菌株。野生菌株經(jīng)單孢純化后，于—80 ℃冰箱中保存。 將保存菌株于PDA 平板上活化，25～28 ℃培養(yǎng)6～7 d備用。

1.3 供試品種的抗病性鑒定

采用成株期人工病圃法[16]。2015年4月將供試棉花品種及對(duì)照品種播種于本所黃萎病人工病圃，每品種4 次重復(fù)，每重復(fù)2 行，行長(zhǎng)5 m，行距0.8 m，每行留苗20 株，隨機(jī)排列，生長(zhǎng)期間正常防治蟲害，不使用任何殺菌劑，栽培管理按日常大田管理進(jìn)行。 依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 22101.5—2009）中所述的五級(jí)分類法評(píng)判發(fā)病級(jí)別，根據(jù)調(diào)查結(jié)果，計(jì)算出發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)病情指數(shù)（IR）。 以相對(duì)病情指數(shù)來(lái)劃分各品種的抗病類型[17-18]。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 快速鑒定方法的建立

1.4.1接菌方法。將各品種播種于滅菌的基質(zhì)（蛭石與沙土體積比為6∶4）中，待2 片子葉長(zhǎng)成時(shí)小心移栽到裝有棉花霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[19]的長(zhǎng)、寬、高分別為29.5 cm、18.5 cm、10 cm 的水培盆中，待1 片真葉平展時(shí)采用蘸根法接菌[20]。 將水培苗取出，放在裝有孢子懸浮液（含量為1×107mL—1）的大燒杯內(nèi)浸泡40 min，保證所有根系均在液面以下，將接完菌的棉苗重新放入植物營(yíng)養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2取樣方法。培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d 時(shí)分別取出棉苗，先后用流動(dòng)的自來(lái)水將根沖洗干凈，再用滅菌蒸餾水沖洗1 遍，用吸水紙充分吸干水分后剪成小段，再用錫箔紙包裹，經(jīng)液氮速凍后，放入—80 ℃冰箱中用于DNA的提取。

1.4.3DNA提取及PCR 反應(yīng)體系。采用CTAB法[21]提取供試菌株根部黃萎病菌（Vd076，下同）的DNA。 以棉花黃萎病菌的持家基因β 微管蛋白基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)高特異引物，Vdβt-F：AACAACAGTCCGATGGATAATTC，Vdβt-R：GTACCGGGCTCGAGATC[19]，不同棉花品種的根部黃萎病菌DNA的定量采用Bio-Rad iQ5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：引物Vdβt-F/Vdβt-R （10 μmol·L—1） 各0.4 μL，2×Ultra SYBR Mixture（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京） 10.0 μL，ddH2O 8.8 μL，模板DNA0.4 μL；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40 個(gè)循環(huán)；融解曲線的程序?yàn)?5 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。測(cè)定黃萎病菌株和棉花根部黃萎病菌DNA含量，稀釋成100 mg·L—1的母液，按照梯度稀釋的原則分別用滅菌去離子水，將DNA稀釋成102、101、100、10—1、10—2、10—3mg·L—1共6 個(gè)質(zhì)量濃度[12]。 每個(gè)質(zhì)量濃度DNA稀釋液取2 μL 作為模板，用實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，對(duì)照分別為滅菌去離子水和100 ng 棉花根部DNA。以Ct值為縱坐標(biāo)，DNA樣品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，繪制DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程、 確定特異性檢測(cè)引物的靈敏度及優(yōu)化PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率。

1.4.5最佳取樣時(shí)間的確定。以冀棉11、中植棉2號(hào)、魯棉研21 為供試品種，接種黃萎病菌后的1、2、3、4、5、6 和7 d 取棉苗根部。每個(gè)處理3 次重復(fù)。檢測(cè)根部黃萎病菌的含量。

1.4.6實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測(cè)供試棉花品種根部黃萎病菌DNA的含量。將28 個(gè)品種根部DNA樣品均制備成100 mg·L—1，取2 μL 為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定DNA樣品的Ct值，根據(jù)回歸方程的公式計(jì)算出100 ng 根部黃萎病菌DNA的含量，反應(yīng)體系和程序同1.4.3。 為了保證樣品間的可比較性，28 個(gè)樣品在一次實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)中全部完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析采用Statistix 8.1 數(shù)據(jù)分析軟件完成。 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR （Real-time quantitative PCR detecting system，即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)）數(shù)據(jù)采用iQ5 自帶軟件MyiQ2 Version 2.1（Bio-Rad Laboratories Co.，USA）生成擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，回歸分析采用Microsoft Office Excel 2003 進(jìn)行。 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α＝0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試棉花品種在病圃中的發(fā)病情況

2015年棉花黃萎病重病田的發(fā)病較為均勻，28 個(gè)品種呈現(xiàn)出不同的抗病性，發(fā)病率在20%～80%，相對(duì)病情指數(shù)分布在9.0～50.0。其中，表現(xiàn)為高抗的品種1 個(gè)，為創(chuàng)0712；表現(xiàn)為抗病的有中棉所49、冀棉958、新植5 號(hào)、冀棉169、銀瑞361、周棉9408、中植棉2 號(hào)共7 個(gè)；耐病品種有新陸早41號(hào)、魯棉研28、新陸中47、中棉所50、瑞雜816、中棉所41、 魯棉研21、 中棉所63、 銀科178、 嘉興5388、百棉1 號(hào)、H559、中棉所8 號(hào)、中棉所35 和銅雜411F1 共15 個(gè)；感病品種有冀棉11、新陸早7號(hào)、湘雜棉7 號(hào)、新陸早42 號(hào)和鄂雜棉29 共5 個(gè)（表1）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以梯度稀釋的黃萎病菌DNA（102、101、100、10—1、10—2、10—3mg·L—1）為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示Ct值（y1）與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（以2 為底）后的DNA質(zhì)量濃度梯度（x1）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)方程為：y1＝—3.081 4x1＋26.34，R2＝0.986 4，擴(kuò)增效率為90.8%，線性范圍達(dá)到6 個(gè)數(shù)量級(jí)，Ct值范圍為19.73～34.58，最低可檢測(cè)到10—3mg·L—1（圖1）。

同樣地，以梯度稀釋的棉花根部黃萎病菌DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示Ct值 （y2） 與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的DNA濃度梯度（x2） 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)方程為：y2＝—2.648 9x2＋25.834，R2＝0.973 8（圖1）。

表1 28 個(gè)棉花品種的發(fā)病率、相對(duì)病情指數(shù)、抗性類型與接種后1 d 根部黃萎病菌DNA含量對(duì)照表

2.3 最佳取樣時(shí)間的確定

在接菌后的不同時(shí)間，感病、耐病和抗病品種根部的黃萎病菌DNA含量呈現(xiàn)出一致的趨勢(shì)，均表現(xiàn)為感病品種冀棉11 的最高，其次是耐病品種魯棉研21，而中植棉2 號(hào)最低（圖2）。 差異顯著性分析表明，在接菌后1、4、5、6、7 d，抗病品種、耐病品種和感病品種之間根部黃萎病菌DNA含量均達(dá)差異顯著水平，在接菌后的1 d，感病品種冀棉11根部黃萎病菌DNA含量最高（3.0 mg·g—1），抗病品種中植棉2 號(hào)最低（0.83 mg·g—1），耐病品種魯棉研21 介于兩者之間（2.02 mg·g—1）。 為達(dá)到快速、準(zhǔn)確的目的，確定接菌后1 d 為最佳取樣時(shí)間。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 3個(gè)品種接菌后不同時(shí)間的黃萎病菌DNA含量比較

圖3 接菌后1d不同品種棉花根部黃萎病菌DNA含量和相對(duì)病情指數(shù)對(duì)比

2.4 不同品種棉花根部黃萎病菌DNA的含量

接種1 d 后，在28 個(gè)棉花品種根部黃萎病菌DNA的含量為0.3～5.0 mg·g—1。 病圃鑒定中表現(xiàn)為高抗的品種創(chuàng)0712（病情指數(shù)為9.0）根部黃萎病菌DNA的含量最低，為0.3 mg·g—1；DNA含量最高的為感病對(duì)照品種冀棉11，達(dá)到5.0 mg·g—1，其病圃鑒定中病情指數(shù)也是最高（50.0）（圖3）。 相關(guān)性分析顯示，供試品種的病情指數(shù)與根部黃萎病菌DNA含量之間呈顯著正相關(guān)（圖4）。

2.5 依據(jù)根部黃萎病菌DNA含量評(píng)價(jià)棉花品種抗病性的標(biāo)準(zhǔn)

28個(gè)供試品種中表現(xiàn)為高抗的品種有1個(gè)，為創(chuàng)0712，其根部黃萎病菌DNA含量為0.3 mg·g—1；表現(xiàn)為抗病的有冀棉169、中植棉2 號(hào)、周棉9408、新植5 號(hào)、冀棉958、銀瑞361 和中棉所49共7 個(gè)，其根部黃萎病菌DNA含量為0.5～1.0 mg·g—1；表現(xiàn)耐病的品種有魯棉研28、百棉1 號(hào)、中棉所41、新陸中47 號(hào)、嘉興5388、銀科178、中棉所63、中棉所50、H559、魯棉研21、新陸早41 號(hào)、中棉所8 號(hào)、瑞雜816、中棉所35 和銅雜411 F1共15個(gè)，其根部黃萎病菌DNA含量為1.2～3.0 mg·g—1；表現(xiàn)感病的品種有新陸早42 號(hào)、鄂雜棉29、湘雜棉7 號(hào)、新陸早7 號(hào)和冀棉11 共5 個(gè)，其根部黃萎病菌DNA含量為3.1～5.0 mg·g—1（表1）。 因此，依據(jù)人工病圃鑒定結(jié)果和熒光定量PCR 的檢測(cè)結(jié)果，推薦基于棉花根部黃萎病菌熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)棉花黃萎病抗性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0～0.3 mg·g—1為高抗品種，0.3～1.0 mg·g—1為抗病品種，1.0～3.0 mg·g—1為耐病品種，＞3.0 mg·g—1的為感病品種。

圖4 供試棉花品種的病情指數(shù)與根部黃萎病菌DNA含量之間的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

鑒于棉花黃萎病發(fā)病周期長(zhǎng)，在病圃和重病田鑒定棉花黃萎病抗性結(jié)果可靠，但是耗時(shí)較長(zhǎng)，為了滿足研究者的不同需求，有必要摸索棉花抗病性快速鑒定的新方法。棉花根部是黃萎病菌侵入寄主的第一道屏障[22]，不同抗病性棉花品種的根系分泌物對(duì)黃萎病菌生殖生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)影響不同，前者起抑制作用，后者則呈現(xiàn)促進(jìn)作用。 分析氨基酸和可溶性糖的組分，發(fā)現(xiàn)抗病品種根系分泌物中的種類較感病品種顯著降低[23-24]。 由于不同抗病性棉花品種根系分泌物的差異，或許會(huì)引起病原菌在根部定植量的差異。目前很多研究結(jié)果已經(jīng)證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)能夠有效地區(qū)分抗病性不同的植物寄主[13-14]，優(yōu)于單純通過(guò)植株外部病癥嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

傳統(tǒng)的溫室培養(yǎng)，一般接種病原菌7 d 后棉花葉片才有輕微的典型黃萎病病斑出現(xiàn)[17]，但是不足以進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)。 本研究通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)能夠在棉花品種表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀前定量檢測(cè)寄主根組織內(nèi)的黃萎病菌DNA含量，在水培棉苗接種后1 d 沒(méi)表現(xiàn)出任何發(fā)病癥狀時(shí)就可以有效區(qū)分不同抗病性的品種[25]。 這使得該技術(shù)克服了傳統(tǒng)抗病鑒定方法中耗時(shí)長(zhǎng)、受環(huán)境影響大、準(zhǔn)確性不高等缺陷。 但是，本研究建立的棉花黃萎病抗性快速評(píng)價(jià)方法僅是根據(jù)病圃鑒定標(biāo)準(zhǔn)菌株Vd076 的根部黃萎病菌DNA含量建立的，后續(xù)研究中研究者如果采用其他菌株，需要重新建立根部黃萎病菌DNA含量與品種抗病性之間的關(guān)系。

綜上，該研究為棉花資源材料、新品種（系）的快捷篩選提供了新思路，在抗病品種分子輔助選擇中有很好的應(yīng)用前景。