張曉婷，張妍，戴劍漉，王以光，赫衛(wèi)清

1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

2 沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司，遼寧 沈陽 110042

必特螺旋霉素 (Bitespiramycin，BT) 是將耐熱鏈霉菌Streptomyces thermotolerans的4″-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因 (4″-Isovaleryltransferase gene，ist) 導(dǎo)入到螺旋霉素 (Spiramycin，SP) 產(chǎn)生菌螺旋鏈霉菌Streptomyces spiramyceticus中進(jìn)行表達(dá)，所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物[1]。BT的主組分是異戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin，ISP) Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。因?yàn)镾P的3位酰基化酶的底物特異性不強(qiáng)，可以同時(shí)識(shí)別乙?；捅；孜铮瑢?dǎo)致出現(xiàn)3種主組分。3位只是羥基的為Ⅰ組分，Ⅱ組分是3位羥基乙?；a(chǎn)物，Ⅲ組分是丙?；a(chǎn)物。BT是多組分藥物，在發(fā)酵產(chǎn)物提純和質(zhì)控方面難度較大。經(jīng)研究初步證實(shí)ISP Ⅰ的藥物活性與BT相當(dāng)，因此可以作為一種單組分藥物進(jìn)行后續(xù)開發(fā)。前期研究中通過阻斷SP的3位酰基化酶基因bsm4，獲得只產(chǎn)SPⅠ的基因工程菌株[2]，再導(dǎo)入2個(gè)拷貝的ist基因[3]，得到只產(chǎn)ISP Ⅰ的工程菌株[4]。但此菌株ISP Ⅰ的產(chǎn)量很低，發(fā)酵液的效價(jià)只有200 μg/mL。為了提高ISP Ⅰ的發(fā)酵產(chǎn)量，又將ist基因和其正調(diào)控基因acyB2整合到ISP Ⅰ菌株的染色體上，通過育種篩選，獲得效價(jià)在800 μg/mL左右的高產(chǎn)菌株S.spiramyceticusWSJ-IA[5–6]。此高產(chǎn)菌株中已經(jīng)包含硫鏈絲菌素和阿普拉霉素兩種抗性基因，利用現(xiàn)有的鏈霉菌質(zhì)粒很難再對(duì)其進(jìn)行定向遺傳操作。因此采用等離子誘變和傳統(tǒng)誘變相結(jié)合的方法對(duì)WSJ-IA菌株進(jìn)行誘變育種，獲得效價(jià)在2 000 μg/mL左右的高產(chǎn)菌株[7]，基本滿足大型發(fā)酵的要求。此菌株共進(jìn)行3次遺傳操作，特別是將bsm4基因進(jìn)行部分刪除后，菌株的產(chǎn)量下降為原株的50%左右。在菌株染色體的2個(gè)不同位置中還包含3個(gè)ist基因，在傳代過程中有發(fā)生同源重組的可能性，不利于菌株的遺傳穩(wěn)定。

為了獲得遺傳更加穩(wěn)定的ISP Ⅰ菌株，利用近幾年新出現(xiàn)的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)[8-9]，可以方便地對(duì)靶基因進(jìn)行阻斷或替換。本研究擬將組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ermEp*控制下的ist基因替換bsm4基因，從而獲得新的ISP Ⅰ菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

螺旋霉素產(chǎn)生菌S.spiramyceticus1941由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建的受體菌，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pKC1139[10]鏈霉菌和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，帶有Apramycin抗性基因，本實(shí)驗(yàn)室保存。CRISPR-Cas9基因組編輯質(zhì)粒pKCcas9do[11]，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院姜衛(wèi)紅研究員惠贈(zèng)。pKCcas9do是以鏈霉菌溫敏質(zhì)粒pKC1139為出發(fā)質(zhì)粒，在培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)停止復(fù)制。pKCcas9do質(zhì)粒含有優(yōu)化的cas9基因，由硫鏈絲菌素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子tipA進(jìn)行調(diào)控；人工合成的j23119啟動(dòng)子控制引導(dǎo)RNA(Single-guide RNA，sgRNA) 基因的轉(zhuǎn)錄；sgRNA由crRNA和tracrRNA組成，在crRNA中人工設(shè)計(jì)20 bp的靶結(jié)合序列，sgRNA 引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。之后可以通過在37 ℃培養(yǎng)和傳代，從宿主菌中去除此質(zhì)粒，獲得沒有抗性而靶基因被改造的目的菌株。實(shí)驗(yàn)中用于構(gòu)建質(zhì)粒的引物序列見表1。

圖1 異戊酰螺旋霉素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of isovalerylspiramycin.

1.1.2 試劑

BT和ISP Ⅰ的對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)室自制。阿普拉霉素 (Apramycin，Am) 購自武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司。硫鏈絲菌素 (Thiostrepton，Tsr)，購自Sigma公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。KOD FX Neo DNA聚合酶 (TOYOBO) 購自北京天佑恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

S.spiramyceticus1941及其突變株的固體培養(yǎng)基 (g/100 mL)：黃豆餅粉2，葡萄糖1，淀粉3，CaCO30.5，NaCl 0.4，瓊脂粉1.5，自然pH值。1 μg/mL的Tsr誘導(dǎo)Cas9基因表達(dá)進(jìn)行定點(diǎn)切割。R2YE培養(yǎng)基用于S.spiramyceticus1941的原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化[12]。

S.spiramyceticus1941及其突變株的種子和發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/100 mL) 詳見文獻(xiàn)[13]。

S.spiramyceticus1941及其突變株的生物檢定培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉膏3.0，酵母膏3.0，蛋白胨(F 403)10.0，葡萄糖1.0，氯化鈉5.0，瓊脂12.0，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆

鏈霉菌總DNA的提取按文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。E.coliDH5α與E.coliET12567感受態(tài)細(xì)胞的制備、分子克隆與鑒定按文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。PCR反應(yīng)采用KOD FX Neo DNA聚合酶反應(yīng)體系。DNA測(cè)序由中美泰和生物技術(shù) (北京) 有限公司完成。

表1 本文中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 構(gòu)建bsm4基因替換質(zhì)粒

利用3對(duì)引物bsm4-LF/LR、ei-F/R和bsm4-RF/RR分別以S.spiramyceticus1941基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得左同源臂 (Left arm)，ermEp*-ist和右同源臂 (Right arm) 3種PCR產(chǎn)物。將這些產(chǎn)物純化后，進(jìn)行重疊延伸PCR，獲得 6.6 kb的目的片段，再進(jìn)行XbaⅠ和HindⅢ酶切消化，與用同樣酶切的pKC1139載體進(jìn)行連接，得到pKC-ei重組質(zhì)粒，如圖2所示。

利用CRIPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因替換，先通過sgRNA-1和sgRNA-R引物擴(kuò)增出引導(dǎo)Cas9進(jìn)行特異性切割的引導(dǎo)序列sgRNA-1，用SpeⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切后回收；利用sgRNA-2和sgRNA-R引物擴(kuò)增出另一個(gè)引導(dǎo)序列sgRNA-2，也用SpeⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切后回收；以pKC-ei為模板，利用Hist-F/R引物擴(kuò)展出4.0 kb片段，用XbaⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切后回收，將sgRNA-1和sgRNA-2分別與4.0 kb片段克隆到pKCcasdo載體 (SpeⅠ/HindⅢ) 上，獲得替換質(zhì)粒pKcas-ei1和pKcas-ei2。

1.2.3 篩選目的菌株

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到S.spiramyceticus1941中，利用1 μg/mL Tsr誘導(dǎo)Cas9 表達(dá)，由sgRNA引導(dǎo)Cas9對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，在質(zhì)粒上有設(shè)計(jì)好的ermEp*-ist替代bsm4基因的同源片段。將發(fā)生同源雙交換的目的菌株置于37 ℃培養(yǎng)，使質(zhì)粒停止復(fù)制，之后通過Am和無抗性平板進(jìn)行篩選，獲得ermEp*-ist替代bsm4基因的目的菌株，進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)

含S.spiramyceticus1941轉(zhuǎn)化子的斜面置于28 ℃培養(yǎng) 5–7 d，挖塊至種子培養(yǎng)基 (50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶)，28 ℃振蕩 (200 r/min) 培養(yǎng)48 h，按1∶50的比例轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中 (50 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶)，28 ℃振蕩 (200 r/min)培養(yǎng)4 d，發(fā)酵液離心取上清液，用5.0 mol/L NaOH調(diào)至pH 8.5–9.0，加等體積乙酸乙酯萃取，8 mL萃取液離心濃縮至干燥，溶于200 μL乙腈，0.22 μm的濾膜過濾后，取3 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè) (日本島津高效液相色譜儀，LC-10ATvp CLASS-VP V6.10)：色譜柱為Kromasil C18，5 μm，4.6 mm×250 mm，流動(dòng)相為乙腈/10 mmol/L pH 7.5–8.0的乙酸銨溶液 (65/35)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)231 nm。LC-MS (美國(guó)Thermo公司LTQ型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀) 檢測(cè)在本所儀器室進(jìn)行，質(zhì)譜條件：ES I源；正離子檢測(cè)；鞘氣 (N2) 流速0.3 L/min；輔助氣 (He) 流速 0.1 L/min；源電壓4.5 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓4.5 V。

圖2 bsm4基因替換質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of bsm4 replacement plasmids.

2 結(jié)果與分析

2.1 bsm4上下游基因分析

BT產(chǎn)生菌S.spiramyceticusWSJ已經(jīng)完成全基因組測(cè)序，并從序列中鑒定出的螺旋霉素生物合成基因簇 (GenBank登錄號(hào)：MH 460451)，3位的?；D(zhuǎn)移酶基因命名為bsm4(圖2)，它的上游基因?yàn)閎sm3，根據(jù)同源性推測(cè)其產(chǎn)物為23S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，參與核糖體23S rRNA的甲基化，與抗生素的抗性相關(guān)。下游基因bsm5為O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，為螺旋霉素的后修飾基因，它與bsm4的開放閱讀框 (Open reading frame，ORF)之間只有5 bp的基因間序列，推測(cè)二者共轉(zhuǎn)錄。要確保bsm5的正常轉(zhuǎn)錄，在使用ermEp*-ist替代bsm4部分序列時(shí)，不能在ist后面設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，同時(shí)需要保留bsm5翻譯所需元件，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此在設(shè)計(jì)時(shí)保留了bsm4基因最后部分的111 bp序列。bsm6基因與bsm5的ORF方向相反，推測(cè)為crotonyl-CoA還原酶。ermEp*-ist替代bsm4后對(duì)其轉(zhuǎn)錄和翻譯沒有明顯影響。

2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒

利用 3對(duì)引物bsm4-LF/LR、eiF/eiR和bsm4-RF/RR以S.spiramyceticus1941基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，分別得到2 699 bp的左同源臂、1 659 bp的ermEp*-ist片段和2 298 bp的右同源臂3種目的片段 (圖3A)，將這3種PCR產(chǎn)物通過重疊延伸PCR，獲得3個(gè)片段拼接的產(chǎn)物 (6.6 kb)。泳道4和5是利用bsm4-LF/RR引物鑒定構(gòu)建好的pKC-ei重組質(zhì)粒，目的片段大小與預(yù)期相符 (圖3B)，并通過測(cè)序進(jìn)行確證。將重組質(zhì)粒pKC-ei通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到S.spiramyceticus1941，利用自然發(fā)生的同源重組來獲得ermEp*-ist替代bsm4的目的菌株。因?yàn)闆]有抗性標(biāo)記只能利用傳代和PCR進(jìn)行篩選，經(jīng)過幾百株次的篩選仍然無法獲得目的菌株。

之后利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒pKCcas9do構(gòu)建2種新的替換質(zhì)粒pKcas-ei1和pKcas-ei2。圖3C中是pKcas-ei1 (泳道6和7) 與pKcas-ei2(泳道8和9) 進(jìn)行XbaⅠ和HindⅢ酶切的電泳圖，均獲得了符合預(yù)期大小的4.0 kb片段；泳道10和11利用Hist-F/R引物驗(yàn)證2種重組質(zhì)粒中的4.0 kb的目的片段；利用sgRNA-1/R和sgRNA-2/R引物分別從pKcas-ei1和pKcas-ei2質(zhì)粒中擴(kuò)增出130 bp左右編碼sgRNA的小片段。最后經(jīng)過測(cè)序證實(shí)2種質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到S.spiramyceticus1941中。

2.3 篩選出目的菌株

利用Am抗性篩選出含有pKcas-ei1和pKcas-ei2重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過Tsr誘導(dǎo)Cas9表達(dá)后，通過傳代和在37 ℃培養(yǎng)使質(zhì)粒停止復(fù)制，篩選出Am抗性消失的菌株 (圖4)，再利用PCR篩選出既消除質(zhì)粒又發(fā)生同源雙交換的目的菌株。只有pKcas-ei1的轉(zhuǎn)化子篩選出了陽性菌株ΔEI，而含pKcas-ei2的轉(zhuǎn)化子均未篩選出目的菌株。通過bsm4-LF/RR引物在原株S.spiramyceticus1941和ΔEI突變株中都擴(kuò)增出了大約6 kb的特異性條帶 (圖3F)，經(jīng)過序列測(cè)定，證實(shí)在ΔEI突變株中目的基因bsm4確實(shí)被ermEp*-ist取代，而且其上下游基因也未發(fā)生突變。

圖3 三種重組質(zhì)粒的電泳檢測(cè)圖Fig.3 Identification of the three recombinant plasmids by electrophoretic detection.1: left arm; 2: ermEp*-ist; 3: right arm; 4–5: pKC-ei (bsm4-LF/RR); 6–7: pKcas-ei1 (Hind Ⅲ/XbaⅠ); 8–9: pKcas-ei2 (Hind Ⅲ/XbaⅠ); 10: pKcas-ei1(Hist-F/R); 11: pKcas-ei2 (Hist-F/R); 12: pKcas-ei1 (sgRNA-1/R); 13: pKcas-ei2 (sgRNA-2/R); 14: S.spiramyceticus 1941; 15: ΔEI; M: DNA marker.

2.4 檢測(cè)目的菌株ΔEI的發(fā)酵產(chǎn)物

通過HPLC檢測(cè)S.spiramyceticus1941原株和ΔEI突變株的發(fā)酵產(chǎn)物，與原株 (圖5B) 相比，在ΔEI突變株中沒有保留時(shí)間與SP Ⅱ和SP Ⅲ組分相似的產(chǎn)物出現(xiàn)，只有產(chǎn)物a保留時(shí)間為4.749 min，與SPⅠ的保留時(shí)間和紫外吸收光譜一致；與BT標(biāo)準(zhǔn)品 (圖5A) 對(duì)比，ΔEI中產(chǎn)物b的保留時(shí)間為16.596 min，與ISP Ⅰ的保留時(shí)間一致(圖5C)。ΔEI突變株的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜全掃描，并未發(fā)現(xiàn)ISP Ⅱ和Ⅲ組分分子量相同的化合物峰。在ΔEI突變株中化合物a的離子峰[M+H]+為m/z843.5，與SP Ⅰ一致；產(chǎn)物b的離子峰[M+H]+為m/z927.62 (圖5D)，與ISP Ⅰ的一致。而且產(chǎn)物b的二級(jí)碎片離子分別為768.36、699.39、540.37及402.28，也與ISP Ⅰ的裂解規(guī)律 (圖6) 和碎片峰數(shù)據(jù)一致 (圖5E和表2)。在ΔEI突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中保留時(shí)間為26 min左右的峰為其他發(fā)酵產(chǎn)物，其[M+H]+為m/z279，遠(yuǎn)小于螺旋霉素的分子量。因此ΔEI突變株發(fā)酵產(chǎn)物中只有SP Ⅰ和ISP Ⅰ組分，證實(shí)新的ISP Ⅰ菌株構(gòu)建成功。

圖4 通過Am抗性和溫度篩選出的目的菌株Fig.4 The target strains screened by Am resistance and temperature.

圖5 ΔEI突變株發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相檢測(cè)圖和質(zhì)譜檢測(cè)圖Fig.5 The profiles of HPLC and MS for the fermentation products of ΔEI strain.(A–C) HPLC detection.A: BT; B:S.spiramyceticus 1941; C: ΔEI.(D) The MS spectrum of compound b in ΔEI strain.(E) Product ion spectrum of [M+H]+of compound b at m/z 927.

表2 異戊酰螺旋霉素的二級(jí)質(zhì)譜碎片峰Table 2 The secondary MS data of isovalerylspiramycin

圖6 異戊酰螺旋霉素離子的裂解規(guī)律圖[16]Fig.6 The cleavage pattern of isovalerylspiramycin’s ion[16].

3 討論

ISP Ⅰ是BT中的一個(gè)主組分，其抗菌活性與BT相似，但其發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)控更容易，還可以做成注射劑型。本研究獲得ISP Ⅰ新產(chǎn)生菌，只通過一次基因改造就實(shí)現(xiàn)目的基因的替換，而且不帶有抗性標(biāo)記，可以持續(xù)進(jìn)行遺傳操作來優(yōu)化菌種。

實(shí)驗(yàn)前期選擇經(jīng)典同源重組的方法，通過替換質(zhì)粒pKC-ei導(dǎo)入目的菌株進(jìn)行同源雙交換，因?yàn)闆]有抗性選擇壓力，自然發(fā)生同源雙交換的概率比較低，很難篩選到目的菌株。CRISPR-Cas9作為一種新的基因編輯技術(shù)可以通過sgRNA指導(dǎo)Cas9蛋白完成對(duì)靶DNA的雙鏈剪切而被廣泛使用，近幾年已經(jīng)成功將該技術(shù)應(yīng)用于腺病毒[17]、果蠅[18]、擬南芥[19]、水稻[20]、斑馬魚[21]等模式物種的基因修飾或改造中。在前期工作的基礎(chǔ)上利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)完成了bsm4基因的替換。開始時(shí)將6.6 kb的外源片段均克隆至pKCcas9do質(zhì)粒上，重組質(zhì)?？傞L(zhǎng)度近20 kb，因質(zhì)粒過大導(dǎo)致原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)失敗?？s短左右同源片段后，構(gòu)建出的新質(zhì)粒順利導(dǎo)入S.spiramyceticus1941中。經(jīng)過Tsr的誘導(dǎo)、Cas9的切割及同源片段的互補(bǔ)后，最終篩選出發(fā)生同源雙交換的目的菌株。但只有pKcas-ei1篩選出了轉(zhuǎn)化子，pKcas-ei2一直未能成功篩選出目的菌株，原因可能是第2個(gè)切割位點(diǎn)不太適合CRISPR-Cas9系統(tǒng)，還有可能是發(fā)生脫靶效應(yīng)導(dǎo)致重要基因失活。

ermEp*是鏈霉菌中組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，包含有2個(gè)-35區(qū)和-10區(qū)，屬于多重啟動(dòng)子，可能還具有雙方向調(diào)控轉(zhuǎn)錄的功能[22]，在3位?；D(zhuǎn)移酶基因的上游是23S rRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶基因，是一種修飾23S rRNA而獲得抗生素抗性的基因，抗生素產(chǎn)生菌的產(chǎn)抗生素能力與其對(duì)抗生素的抗性之間具有一定的相關(guān)性，抗性基因的高表達(dá)通常能提高抗生素的產(chǎn)量[23–25]。用ermEp*-ist基因替換bsm4基因可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)2個(gè)目標(biāo)：1) 將3位酰基轉(zhuǎn)移酶基因刪除，菌株只產(chǎn)生SP Ⅰ；2) 高表達(dá)的ist基因整合到宿主染色體上穩(wěn)定存在，而且位于螺旋霉素生物合成基因簇之中，有利于進(jìn)行異戊酰基化修飾。另外，ermEp*還可能會(huì)提高上游的抗性基因的表達(dá)，從而增加螺旋霉素的產(chǎn)量。而且只經(jīng)過1次遺傳操作和含有1個(gè)ist基因，對(duì)菌株的影響較小，菌株的遺傳穩(wěn)定性更好。

從HPLC檢測(cè)結(jié)果來看，尚有大量的SP Ⅰ沒有轉(zhuǎn)化成ISP Ⅰ，說明ermEp*控制下的ist基因并沒有獲得理想的高表達(dá)，但其效價(jià)為420 μg/mL，比原始的ISP Ⅰ菌株提高了2倍多。通常來講，經(jīng)過基因工程操作的菌株的產(chǎn)量開始時(shí)一般都偏低，還需要進(jìn)行相應(yīng)的育種分離操作，才能篩選出效價(jià)和ISP Ⅰ都較高的新菌株。將來還可利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)把已經(jīng)構(gòu)建的ist高表達(dá)盒[26]導(dǎo)入到ΔEI菌株中，將會(huì)進(jìn)一步提高SP Ⅰ轉(zhuǎn)化為ISP Ⅰ的產(chǎn)量，還可進(jìn)行其他遺傳操作來獲得更加優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)ISP Ⅰ的菌株。