張少為，陳 閣，張耀中，米 源，廖海江，王 雷

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸心外科，石家莊 050011)

食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一，其在全球所有惡性腫瘤的發(fā)病率占第八位，病死率占第六位。我國是食管鱗癌高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)病率和病死率均居世界第一位，在國內(nèi)食管癌位居全部惡性腫瘤死亡第四位[1]。目前傳統(tǒng)治療方法主要是手術切除輔助放化療，但食管癌在被確診時多是中晚期，術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的比例高，預后不佳。食管癌發(fā)病機制與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關，因此從基因分子水平闡明其發(fā)生機制是目前研究熱點。PLK1(polo-like kinase)作為絲氨酸-蘇氨酸激酶家族之一，是細胞有絲分裂關鍵的調(diào)控因子，其在啟動、維持和有絲分裂的過程中發(fā)揮重要的作用。研究表明PLK1在黑色素瘤、皮膚梅克爾細胞癌、胰腺癌和肝癌等多種惡性腫瘤中高表達[2-5]，下調(diào)PLK1表達可以通過減少細胞增殖、促進凋亡等機制起到明顯抗腫瘤作用。目前全世界關于PLK1 與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間相關的研究較少。本研究通過沉默PLK1基因表達，探討其與食管鱗癌腫瘤生物學行為的分子機制，旨在為食管鱗癌的靶向治療提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人食管鱗癌細胞株KYSE-30購自上海通派生物科技有限公司；胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司；Ham和RPMI1640 培養(yǎng)液購自上海鈺森生物技術有限公司；SilencerTMSelect PLK1和control siRNA購自美國Life Technologies公司；TaqMan?PLK1引物和探針(Hs00983227_m1)和TaqMan?GAPDH(Hs02758991_g1)購自美國Life Technologies公司；75%酒精購自北京華興科諾公司；LipofectamineTMRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；iScriptTMcDNA合成試劑盒購自美國Bio-Rad公司；TaqMan?基因表達預混液購自美國Applied Biosystems公司；結(jié)晶紫購自美國Sigma公司；2X Laemmli Sample Buffe、Tris/甘氨酸/蛋白電泳緩沖液和Mini-PROTEAN TGX 預制膠購自美國Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒購自上海譜振生物科技有限公司；鼠抗人Vimentin 和GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人PLK1和C-myc單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人MMP2單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；West Femto最高靈敏度化學發(fā)光底物試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；Pierce-BCA 蛋白分析試劑盒購自上海創(chuàng)賽科技有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore公司；甲醇購自天津永大化學試劑有限公司；Transwell膜嵌套、matrigel 膠購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將食管鱗癌KYSE-30細胞用RPMI 1640 和Ham細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)液在37 ℃、CO2維持在5%左右的恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合達80%左右并將生長狀態(tài)良好的食管鱗癌KYSE-30細胞接種到6孔板上，按照轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染并設立PLK1 siRNA組及空白對照Control siRNA組，終濃度均為100 nmol/L，轉(zhuǎn)染完成后再培養(yǎng)48 h。

1.2.2Real time熒光定量PCR法檢測PLK1 mRNA的表達 首先進行總RNA的提取，用PBS洗滌轉(zhuǎn)染好的食管鱗癌KYSE-30細胞，參照總RNA提取試劑盒說明書提取每組的總RNA，純化RNA上機檢測RNA濃度。然后進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照iScriptTMcDNA合成的說明書進行每組樣本cDNA的反轉(zhuǎn)錄，在25 ℃5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min的條件下進行cDNA合成并保存?zhèn)溆?。最后進行Real time熒光定量PCR擴增，將Taqman基因表達預混液、TaqMan?PLK1物和探針0.5 μL或TaqMan?GAPDH引物和探針、樣本cDNA，上機在95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s的條件下進行PCR擴增，共40個循環(huán)。以GAPDH的Ct值為標準，用2-ΔCt法進行分析。

1.2.3Western blot檢測PLK1蛋白的表達 PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h后KYSE-30細胞加到6孔板上，每孔總蛋白提取試劑100 μL并含有蛋白酶抑制劑的M-PER細胞，收集樣本的總蛋白提取液并離心取上清液，用BCA 法測定樣本的總蛋白濃度。再轉(zhuǎn)印槽中加上Tris/甘氨酸/蛋白電泳液，在Mini-PROTEAN TGX 預制膠中行每組樣本蛋白上樣，進行電泳。用雙蒸水沖洗凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中轉(zhuǎn)至PVDF膜(冰浴)，室溫含5%脫脂奶粉的TBST液封膜1 h，加入一抗PLK1(1∶1 000)、一抗C-myc(1∶1 000)、一抗Vimentin(1∶10 000)、一抗GAPDH(1：20 000)、一抗MMP2(1∶1 000)、4 ℃搖床孵育過夜。第2天TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，將發(fā)光底物滴于PVDF膜上，5 min后于暗室曝光顯影，用 Image軟件對蛋白灰度值進行分析。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期的變化 將轉(zhuǎn)染48 h的KYSE-30細胞用PBS洗滌，胰酶消化，PBS漂洗，離心，吹打均勻重懸細胞，加入4 ℃70%冰乙醇固定30 min以上。PBS去除乙醇，重懸細胞并加碘化丙啶和RNaseA的PBS，避光4 ℃染色。尼龍網(wǎng)過濾后用MuticycleAV分析軟件進行細胞周期分析，PI 激發(fā)波長488 nm。

1.2.5Transwell侵襲實驗 液化Matrigel膠于聚碳酸酯膜。將轉(zhuǎn)染48 h的KYSE-30細胞加入Transwell小室上室。下室加10%PBS的細胞培養(yǎng)液，于恒濕恒溫箱中進行孵育，24 h后將靠近內(nèi)室一面的基質(zhì)膠和細胞去掉，室溫甲醇固定30 min，最后用0.1%結(jié)晶紫染色清水漂洗晾干膜，緊接著在顯微鏡下進行觀察，隨機選取4個高倍視野進行計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1Real time熒光定量PCR法檢測PLK1 mRNA的表達 PLK1 siRNA組PLK1 mRNA表達0.29±0.03較Control siRNA 組1.00±0.02明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=37.90，P=0.000)，見圖1。

圖1 兩組PLK1 mRNA的表達情況

2.2Western blot 檢測PLK1蛋白的表達 PLK1 siRNA組PLK1、 C-myc、Vimentin、MMP2蛋白表達較Control siRNA組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=40.72、24.57、25.15、8.85，P<0.05)，見圖2。

2.3流式細胞術檢測細胞周期變化 PLK1 siRNA組G2/M、S期細胞與Control siRNA組比較明顯降低(P<0.05)，G0/G1期細胞無明顯變化(P>0.05),見表1。

表1 流式細胞術檢測細胞周期的變化

2.4Transwell侵襲實驗 與Control siRNA組穿膜細胞數(shù)(94.00±4.04)個比較，PLK1 siRNA組(44.00±4.51)個明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.30，P=0.000)，見圖3。

A:Contor siRNA組；B：PLK1 siRNA組

圖3兩組細胞侵襲能力的變化(×400)

3 討 論

PLKs是絲氨酸/蘇氨酸激酶，家族中包括從PLK1到PLK5，在細胞周期的各個時相的調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。其中PLK1作為細胞周期檢控點的主要調(diào)節(jié)者，在有絲分裂過程與紡錘體形成及染色體的分離具有密切關系，此外，研究表明PLK1的高表達和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關，可以作為一個潛在的有效抗腫瘤靶點[6-8]。RNA干擾技術屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，可以使靶基因mRNA沉默達到定向敲除與腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展相關基因的功效，因其具有高特異性和高效性等特點作為一種嶄新的實驗方法被廣泛應用于基因功能的研究及腫瘤細胞信號傳導通路的分析。本研究應用siRNA沉默KYSE-30細胞PLK1基因表達，結(jié)果顯示KYSE-30細胞中存在PLK1高表達，RNA干擾可明顯減少腫瘤細胞PLK1 mRNA和蛋白表達。

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，受細胞周期蛋白、多種激素、細胞周期蛋白激酶、 三磷酸肌醇(IP3)、Ca信使系統(tǒng)及細胞周期蛋白激酶抑制劑等多個蛋白共同調(diào)節(jié)，當細胞周期紊亂可導致腫瘤細胞異常增殖。PLK1 作為細胞周期依賴性激酶，在細胞有絲分裂調(diào)節(jié)過程中可以通過促進中心體成熟、細胞周期由G2期進入M期及染色體分離等功能發(fā)揮重要作用。阻止癌細胞增殖和促進凋亡是腫瘤基因治療的基本原則，AMANI等[9]采用PLK1靶向抑制劑BI 6727處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)現(xiàn)，可以通過顯著阻滯細胞于G2/M期，導致腫瘤細胞增殖和凋亡增加。本研究應用流式細胞術分析了轉(zhuǎn)染PLK1 siRNA對KYSE-30細胞的周期分布變化的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組較空白對照組相比可將更多細胞阻滯于G2/M期，從而調(diào)控腫瘤細胞的增殖，這與AMANI等的結(jié)果相一致。TAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)PLK1是腫瘤細胞中PDK1-PLK1-Myc通路的核心成分，活化狀態(tài)的PLK1進一步激活Myc促進腫瘤的生長增殖和分化。筆者同時檢測了細胞周期相關蛋白C-myc的表達來進一步探討食管鱗癌細胞PLK1表達和周期變化的可能機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默PLK1基因后PLK1和C-myc蛋白表達下調(diào)，表明在食管鱗癌細胞周期調(diào)控中PLK1發(fā)揮重要作用，其可以通過上調(diào)C-myc表達促進細胞異常增殖。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮來源的惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制之一，主要以E-Cadherin等上皮表型標志下調(diào)[11]，Vimentin等間質(zhì)表型特征分子表達上調(diào)為特征[12-13]。Vimentin可以通過調(diào)節(jié)MT1-MMP改變?nèi)橄侔┘毎酿じ郊斑w移能力，并且與患者的預后密切相關，下調(diào)Vimentin表達可以影響腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[14]。此外，細胞外基質(zhì)的降解也是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移重要的一部分，腫瘤細胞可以通過破壞細胞外基質(zhì)擴散并浸潤到周圍正常組織，MMP2是鋅結(jié)合內(nèi)肽酶家族成員之一，高表達的MMP2在多種腫瘤組織中可以通過降解、破壞腫瘤附近的細胞基質(zhì)，促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究表明抑制PLK1表達后可導致Vimentin和MMP2蛋白表達下調(diào)，Transwell侵襲實驗進一步顯示穿膜細胞數(shù)明顯減少，可以說明敲掉PLK1基因后可以抑制腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并減少了MMP2介導的細胞外基質(zhì)的破壞，從而降低食管鱗癌細胞的侵襲能力，分析其原因可能是PLK1通過誘導食管鱗癌細胞的EMT過程促進侵襲轉(zhuǎn)移。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PLK1在食管鱗癌細胞的異常增殖和促進侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，但是具體的調(diào)控機制尚需進一步研究，PLK1有望成為食管鱗癌分子靶向治療的重要靶標。