向 薇，程 實，馬 玲

(1.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊 830011；2.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，四川瀘州 646000)

肥胖是全世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題[1]，從細胞層面看，肥胖發(fā)生的原因在于脂肪細胞體積肥大和增生所造成，而這些現(xiàn)象的主要原因之一就是細胞內(nèi)脂肪過度的堆積[2]，其在形態(tài)上主要表現(xiàn)為中央超大脂滴的形成。細胞形態(tài)的改變，脂滴作為脂肪細胞內(nèi)一種特殊的細胞器，在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過程中起到關鍵作用，其過度的膨大將會導致生物體脂質(zhì)代謝紊亂[3]，是胰島素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病等疾病的重要特征之一[4]。

1,25二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]在骨骼中的作用早已被大量且深入的研究，而近些年，越來越多的證據(jù)表明1,25(OH)2D3的缺乏是肥胖的獨立危險因素[5]。細胞研究也發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可在體外培養(yǎng)的脂肪細胞中起到調(diào)節(jié)脂肪代謝的作用，并明顯抑制脂肪生成，減少細胞內(nèi)脂肪含量[2]。雖然1,25(OH)2D3對脂肪細胞脂質(zhì)代謝的研究已有很多，但結果并不一致，且其對脂肪細胞脂滴融合能力影響的研究還未見報道。本研究觀察其對細胞脂滴形態(tài)和脂肪細胞脂滴融合相關基因的影響，為其有效地防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 3T3-L1細胞系購自美國ATCC公司，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基。當細胞生長至80%～90%時進行傳代。

1.1.2主要試劑及儀器 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、1,25(OH)2D3(美國Sigma公司),胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，上海生工生物工程股份有限公司)，棕櫚酸(PA，北京Solarbio公司)，牛血清白蛋白(BSA，德國Biofroxx公司)，油紅O、BCA法蛋白檢測試劑盒、三酰甘油(TG)試劑盒(南京建成生物技術研究所)；RNAiso Plus和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (日本TAKARA公司)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，酶標儀(美國BIO-RAD公司)，CO2培養(yǎng)箱、離心機、超凈工作臺、PCR儀(美國Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)，電子天平(上海天美天平儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1誘導液的配置 誘導液Ⅰ，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L的IBMX、10 μg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米。誘導液Ⅱ，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10 μg/mL胰島素。

1.2.2不同濃度PA溶液 取30% BSA溶液，置于55 ℃水浴中30 min；將PA置于0.01 mol/L的NaOH溶液中配成10 mmol/L的PA儲存液，于70 ℃水浴中30 min，在70 ℃條件下分別取330 μL的30% BSA溶液迅速與100、300、600、900 μL PA儲存液混合振蕩，用10%FBS高糖DMEM定容于10 mL，于超凈臺中過濾，分別得到100、300、600、900 μmol/L的PA培養(yǎng)液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3誘導分化 采用“雞尾酒法”，將細胞以每毫升2×105個接種于6孔板中，待細胞接觸抑制48 h后，將細胞培養(yǎng)基換為誘導液Ⅰ(計為分化第0天)，每2天換1次液。4 d后換誘導液Ⅱ，每2天換1次液。至分化第8天時，90%以上細胞分化為成熟脂肪細胞。

1.2.4肥大脂肪細胞模型的建立 將細胞以每毫升2×104個接種于96孔板中，當細胞接觸抑制后按上述方法進行誘導分化，待3T3-L1細胞分化為成熟脂肪細胞后，分別用0、100、300、600、900 μmol/L的PA培養(yǎng)液干預24 h后，進行MTT細胞活力檢測。同樣將細胞以每毫升2×105個接種于6孔板中，待細胞分化為成熟脂肪細胞后，用不同濃度的PA培養(yǎng)液干預24 h后，測細胞質(zhì)TG，根據(jù)試劑盒說明書進行。篩選出最佳干預濃度。

1.2.5不同濃度1,25(OH)2D3干預 將正常培養(yǎng)的3T3-L1細胞按照每毫升2×105個接種于6孔板中，當細胞接觸抑制48 h后進行誘導分化。待細胞分化為成熟脂肪細胞后，根據(jù)篩選出的最佳PA濃度進行造模，造模24 h后分別用1、10、100 nmol/L的1,25(OH)2D3對模型細胞干預24 h，并設置分化成熟的脂肪細胞為對照組，PA干預的為模型組，以及3個不同濃度的干預組。

表1 引物設計和合成

PPAR:過氧化物酶體增殖物激活受體；CIDE:細胞死亡誘導DFF45樣效應物

1.2.6油紅染色 按照上述方法誘導分化8 d后，將培養(yǎng)基吸出，每孔加1 mL的PBS沖洗2次，每孔加1 mL的4%多聚甲醛固定15～20 min。棄去多聚甲醛，PBS沖洗后，加入油紅染色15 min，吸出染劑后加入PBS潤洗，于倒置顯微鏡下觀察各組脂滴形成情況。

1.2.7脂滴數(shù)量和平均直徑 采用Image-pro plus 6.0計算干預后各組脂滴數(shù)量和平均直徑。

1.2.8TG水平 檢測干預后各組TG水平。

1.2.9RT-qPCR 提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋5倍后，RT-qPCR檢測PPAR-α、PPAR-γ、CIDE-a、CIDE-c、UCP-1、PLIN-1 mRNA表達情況。PCR的反應條件為：95 ℃ 30 s，預熱；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。上下游引物見表1。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析。對實驗所得計量數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，方差齊者多組間直接用單因素ANOVA分析組間整體差異，如有差異則用Tukey法進行兩兩比較;方差不齊者用Brown-Forsythe對單因素ANOVA結果進行校正，如果有差異則用Games-Howell法進行兩兩比較。如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性，則用非參數(shù)的秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1篩選最佳PA濃度 MTT檢測結果表明，600 μmol/L和900 μmol/L PA可使分化后的3T3-L1細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，不作為最佳造模濃度。剩余組別中300 μmol/L組細胞TG水平最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究最終選用300 μmol/L PA濃度作為造模最佳濃度，見圖1。

A:各濃度PA干預后細胞活力；B:各濃度PA干預后TG水平；*：P<0.05，與對照組相比

圖1篩選最佳PA濃度造模

A:各組TG水平；B:各組脂滴數(shù)量；C:各組脂滴平均直徑；*P<0.05，與模型組比較

圖2不同濃度1,25(OH)2D3對細胞脂滴的影響

A：對照組；B：模型組；C：1 nmol/L組；D：10 nmol/L組；E：100 nmol/L組

圖3各組細胞油紅染色(×200)

A：PPAR-α；B:PPAR-γ；C：CIDE-a；D：CIDE-c；E：PLIN-1；F：UCP-1；*：P<0.05，與模型組比較

圖4各組細胞脂滴代謝相關基因mRNA表達情況

2.2脂滴直徑和計數(shù) 用不同濃度1,25(OH)2D3干預模型細胞后油紅O染色結果顯示，模型組脂滴數(shù)量明顯多于對照組(P<0.05),脂滴平均直徑大于對照組(P<0.05)；與模型組相比，1 nmol/L組無論是脂滴數(shù)量還是平均直徑差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，10、100 nmol/L組脂滴數(shù)量明顯增加，脂滴平均直徑明顯減小(P<0.05)；模型組TG水平明顯高于對照組(P<0.05)，而10、100 nmol/L組TG水平明顯低于模型組(P<0.05)，見圖2、3。

2.3脂滴相關基因mRNA表達情況 模型組PPAR-α mRNA表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；1,25(OH)2D3干預24 h后，高、中、低3個濃度組的PPAR-α mRNA表達均明顯高于模型組(P<0.05)。PPAR-γ mRNA表達各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組CIDE-a mRNA表達明顯高于對照組(P<0.05)，而1 nmol/L組與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，10、100 nmol/L組CIDE-a mRNA表達明顯低于模型組(P<0.05)。CIDE-c mRNA表達在對照組與模型組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，1,25(OH)2D3干預后的各濃度組均明顯低于模型組(P<0.05)。UCP-1 mRNA表達只在100 nmol/L組與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PLIN-1 mRNA表達在對照組與模型組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，10、100 nmol/L組與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

3 討 論

脂滴是一個動態(tài)的細胞器，其核心主要是由TG和膽固醇酯構成，在表面由單層磷脂包圍，脂滴作為儲存能量和代謝脂肪酸及固醇的細胞器，負責大量膜結構和激素的合成。脂滴在不同的細胞中有不同的表面蛋白，它們調(diào)節(jié)著脂滴的結構和功能，其中包括PPAR家族、CIDE家族、PAT家族等。

本研究中采用300 μmol/L PA對誘導分化8 d的3T3-L1細胞進行肥大效果的模擬，雖然通過油紅染色觀察到細胞內(nèi)形成了大量脂滴，但無論是分化后的對照組還是模型組，都沒有觀察到脂肪細胞典型的中央大脂滴出現(xiàn)。在其他學者對3T3-L1細胞成脂分化的研究中，分化后油紅染色拍照的放大倍數(shù)一般在40倍甚至更小，不能觀察出細胞內(nèi)脂滴的形態(tài)[6-7]，而BOSCHI 等[8]用與本文相同的方法對3T3-L1細胞進行成脂誘導分化，8 d后油紅染色，顯微放大倍數(shù)400倍的結果中并未發(fā)現(xiàn)中央大脂滴，對此疑問可能還需進一步研究探討，體外研究用于誘導細胞成脂的方法可能還不夠完善。通過軟件對顯微照片中脂滴量化后，模型組脂滴無論從數(shù)量還是平均直徑上相較對照組均明顯增加。1,25(OH)2D3對模型細胞進行干預后，10、100 nmol/L組脂滴平均直徑相比于模型組明顯降低。而對于1 nmol/L濃度的1,25(OH)2D3從油紅染色的照片中并未觀察到與模型組脂滴明顯的形態(tài)變化。

PPARs在脂質(zhì)代謝過程中的作用已經(jīng)開展了大量研究[9]，其中PPAR-α是調(diào)節(jié)能量代謝和脂質(zhì)氧化的關鍵因素，在脂類代謝調(diào)節(jié)中起著樞紐作用；而PPAR-γ是脂肪細胞分化和脂肪細胞因子表達的主要調(diào)節(jié)劑，參與脂肪細胞分化和糖脂代謝的調(diào)節(jié)[10]。除PPARs近幾年有關脂質(zhì)合成代謝的研究發(fā)現(xiàn)CIDE是重要的調(diào)節(jié)蛋白，CIDE-a和CIDE-c在脂肪細胞脂滴代謝的調(diào)控中都有重要作用[11]。同時，PAT家族中PLIN-1在脂肪細胞中高度表達，并調(diào)節(jié)脂質(zhì)的分解過程。本研究中，10、100 nmol/L組的PPAR-α和PLIN-1 mRNA表達明顯高于模型組，而CIDE-a和CIDE-c mRNA表達相比模型組明顯下降，提示10、100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3干預可以在一定程度上抑制PA對分化后3T3-L1細胞造成的脂肪堆積作用，抑制脂滴融合，與CHANG等[2]研究中產(chǎn)生促進脂肪分解效果的劑量相同。該研究只在100 nmol/L組UCP-1 mRNA表達與模型組有統(tǒng)計學差異，提示100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3能增加空熱產(chǎn)生，促進脂代謝。雖然 1 nmol/L組與模型組相比脂滴變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但PPAR-α mRNA表達相比模型組明顯升高，CIDE-c mRNA表達明顯下降，提示1 nmol/L濃度的1,25(OH)2D3濃度太低，在24 h的干預時間內(nèi)還不足以對細胞脂滴的生物代謝產(chǎn)生明顯的變化。而在JI等[12]研究中發(fā)現(xiàn)1 nmol/L的1,25(OH)2D3就可產(chǎn)生明顯的效果，但還未見有用1 nmol/L濃度1,25(OH)2D3干預成脂分化后3T3-L1細胞的報道。1,25(OH)2D3干預后，尤其是10、100 nmol/L濃度，包括CIDE-a、CIDE-c、PLIN-1等均出現(xiàn)明顯的變化，提示其可能抑制了脂質(zhì)在細胞內(nèi)的堆積。PPAR-γ是調(diào)節(jié)脂肪細胞脂質(zhì)代謝的主要因子，主要表達在脂肪組織中，用于調(diào)節(jié)脂肪細胞的活動，脂質(zhì)的代謝，應答胰島素信號，并且與炎癥相關[10]，但PPAR-γ mRNA表達在所有組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與CHANG等[2]的研究結果不一致。而BOLSONI-LOPES等[13]用200 μmol/L的棕櫚油酸干預成脂分化后的3T3-L1細胞，發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸可以增加脂肪細胞脂質(zhì)的分解，并且此過程依賴于PPAR-α的激活，而非PPAR-γ。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可以抑制PA造成的成脂分化后3T3-L1細胞的脂質(zhì)堆積，10、100 nmol/L濃度效果較為明顯，脂滴體積變小，數(shù)目變多，脂滴融合受抑制，脂肪降解的速度加快，導致脂肪細胞儲存脂肪的能力降低。1,25(OH)2D3可能通過激活PPAR-α來起到抑制脂肪堆積的效果，而PPAR-γ可能并不參與其中。