大腸桿菌外膜蛋白F的原核表達、多克隆抗體制備及生物信息學分析

伍娜娜，康 超，榮 娜，劉 祥，陳春琳，陳 琛，丁 銳，吳三橋

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001；2.陜西省天麻山茱萸工程技術研究中心，陜西 漢中 723001)

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)屬于革蘭氏陰性短桿菌，是一種人畜共患的機會性病原菌，在一定條件下可引起人類的腦膜炎、腹瀉、敗血癥[1-4]，奶牛和奶山羊的乳房炎[5]，以及雞的肝周炎、心包炎、氣囊炎和臍炎等疾病[6]，不僅威脅人類健康，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，還會對奶制品帶來巨大的安全隱患。目前，大腸桿菌引起感染性疾病的主要治療藥物是抗生素[7]，但大量使用抗生素會使細菌產(chǎn)生耐藥性[8-9]，因此迫切需要深入研究其耐藥機制，并開發(fā)疫苗來防治大腸桿菌病[10]。

在致病性的大腸桿菌中，外膜蛋白是其產(chǎn)生致病性的主要因素[11]。大腸桿菌外膜蛋白F(Outer membrane protein F，OmpF)是由16個反平行β鏈和8個連接環(huán)形成的三聚體桶狀結構[12-13]，營養(yǎng)物質和抗生素大多經(jīng)過此通道進出菌體。研究發(fā)現(xiàn)，OmpF蛋白的表達量差異可導致細胞膜的通透性改變，這與細菌的耐藥性密切相關[14-16]。此外，OmpF蛋白具有高度免疫原性，WANG等[2]免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌OmpF蛋白可激活小鼠機體免疫反應，產(chǎn)生特異性抗體，并能有效抵抗大腸桿菌侵染，可作為大腸桿菌病的候選疫苗。

本研究通過克隆大腸桿菌ompF基因，探究OmpF蛋白表達菌株最佳的表達條件及培養(yǎng)條件，將純化后的OmpF蛋白免疫小鼠，制備小鼠OmpF多克隆抗體，然后通過Western blotting檢測抗OmpF抗體的特異性，并借助生物信息學方法進行OmpF蛋白的系統(tǒng)進化關系分析，為進一步研究OmpF蛋白結構和功能提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

E.coliK12、E.coliDH5α和E.coliBL21菌株以及pET-32a質粒由陜西理工大學生物科學與工程學院生物化學與分子生物學實驗室保存；Taq酶、T4-DNA連接酶、DNA Marker、限制性內切酶XhoⅠ與BamHⅠ購于TaKaRa公司；蛋白質Marker購于北京安諾倫生物科技有限公司；質粒提取試劑盒購于北京佰億新創(chuàng)科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購于杭州博日科技有限公司；引物合成和基因測序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；昆明鼠購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心。

1.2 大腸桿菌ompF基因重組質粒構建

根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的E.coliK12菌株ompF基因序列(登錄號：NC_000913.3)，用Primer 5.0軟件設計ompF基因引物，Primer 1：5′-TTCGGATCCATGATGAAGCGCAATATT-3′；Primer 2：5′-AGTCTCGAGTTAGAACTGGTAAACGAT-3′，分別在Primer 1和Primer 2兩端加入限制性內切酶位點BamHⅠ和XhoⅠ(劃線序列)與保護堿基。對目的基因ompF進行PCR擴增，反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸150 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min，16 ℃保存。吸取2 μL的PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳。用DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目的基因產(chǎn)物，雙酶切后將回收的片段連接到pET-32a質粒載體，然后轉化至E.coliDH5α中，重組質粒通過BamHⅠ及XhoⅠ限制性內切酶消化后，進行電泳分析，對陽性重組克隆進行測序，將測序正確的ompF重組質粒轉入E.coliBL21菌株，構建ompF重組表達菌株。

1.3 大腸桿菌OmpF蛋白表達鑒定及純化

將轉入ompF重組質粒的E.coliBL21菌株置于5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，然后吸取500 μL轉接至5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG再誘導6 h，8 000 r/min、4 ℃離心5 min收集菌體，沸水浴煮樣5 min后進行12%的SDS-PAGE電泳，對OmpF蛋白進行純化。

1.4 大腸桿菌OmpF蛋白表達條件優(yōu)化

為獲得蛋白質最優(yōu)的表達條件，用L9(34)正交試驗模型[17]，包括表達菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件及蛋白質的最優(yōu)誘導表達條件2種，因子與水平分別如表1和表2所示。

表2 大腸桿菌OmpF蛋白誘導條件正交試驗因子與水平 Tab.2 The factor and level of orthogonal experiment for E.coli OmpF induction

OmpF表達菌株培養(yǎng)條件的正交試驗過程：將OmpF表達菌株接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜，吸取1 mL培養(yǎng)后菌液轉接入表1條件下所配置的新鮮培養(yǎng)液中，依據(jù)正交試驗模型要求，培養(yǎng)OmpF表達菌株8 h后記錄所得菌液的OD600值，并對數(shù)據(jù)進行方差和極差分析，獲得菌株最佳培養(yǎng)條件。

表達菌株的蛋白質誘導條件正交試驗過程：依據(jù)表達菌株最優(yōu)的培養(yǎng)條件，將OmpF菌株接入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min快速培養(yǎng)菌液到表2條件下不同OD600值時，再依據(jù)正交試驗模型要求，加入IPTG誘導OmpF蛋白的表達。吸取1 mL誘導一定時間后的菌液于10 000 r/min離心1 min，收集沉淀并加入300 μL的2×SDS Loading buffer徹底混勻，沸水中煮樣5 min，上樣量為10 μL，用SDS-PAGE對總蛋白進行分析。采用凝膠分析軟件(Phoretix 1D)對電泳后得到的OmpF蛋白表達圖譜進行光密度分析，并用SPSS 21.0軟件進行不同因子的顯著性分析[17]。

1.5 大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體制備

選取體質量約20 g的昆明鼠作為供試小鼠。取100 μg弗氏完全佐劑乳化后的純化重組蛋白對每只小鼠進行免疫，間隔14 d后，用相同劑量的抗原和弗氏不完全佐劑進行加強免疫，然后于間隔7 d后進行第2次加強免疫。于末次加強免疫7 d后，收集小鼠血液，進行血清分離，用于進行Western blotting[18]。

1.6 Western blotting對大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體特異性的檢測

以健康血清作為陰性對照，并將純化后的重組OmpF蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳進行分離。在4 ℃下將凝膠上出現(xiàn)單一條帶的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，將膜置于含有5%脫脂牛奶的1.5中制備的小鼠抗血清(1∶400稀釋)TNT緩沖液中，于37 ℃溫育1 h，然后用TNT緩沖液洗滌后，將膜置于山羊抗鼠二抗中，4 ℃孵育過夜，最后用TNT緩沖液清洗后使用DAB進行顯色[19]。

1.7 大腸桿菌OmpF蛋白生物信息學分析

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取的氨基酸序列，利用DNAMAN 8.0軟件對不同菌株OmpF蛋白序列進行同源性分析，利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過String蛋白質相互作用預測網(wǎng)站http://www.string-db.org/，預測OmpF與其他蛋白質的互作關系網(wǎng)絡。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌ompF基因重組質粒的構建

利用PCR擴增技術從E.coliK12基因組中擴增出1 089 bp的ompF基因產(chǎn)物(圖1)。將其克隆到表達載體pET-32a中，構建pET-32a-ompF質粒，并利用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組表達質粒pET-32a-ompF進行消化，得到約1 000 bp的條帶，與目的基因大小一致(圖2)。對陽性重組克隆進行測序，結果與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的ompF基因序列(GenBank：NC_000913.3)具有100%同源性。

M：DL2000 DNA Marker; 1：ompF基因M：DL2000 DNA Marker; 1：ompF gene圖1 大腸桿菌ompF基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of E.coli ompF gene

M：DL2000 DNA Marker; 1：pET-32a-ompF重組表達質粒; 2：pET-32a-ompF重組表達質粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切M：DL2000 DNA Marker; 1：pET-32a-ompF plasmid; 2：pET-32a-ompF plasmid digested by BamHⅠ and XhoⅠ圖2 pET-32a-ompF重組表達質粒的雙酶切結果Fig.2 Identification of pET-32a-ompF recombinantplasmid by restriction enzyme analysis of BamHⅠ and XhoⅠ

2.2 大腸桿菌OmpF蛋白的表達與純化

選用測序正確的重組克隆菌株，用IPTG誘導重組OmpF蛋白在E.coliBL21中表達時發(fā)現(xiàn)，誘導6 h時可獲得OmpF蛋白的高表達，如圖3所示，SDS-PAGE電泳分離獲得分子質量約為58.4 ku的蛋白質條帶，表達量和純度均較高，包含理論分子質量約為38 ku的OmpF蛋白和20.4 ku的pET-32a質粒融合蛋白標簽，然后用SDS-PAGE電泳切膠的方法，得到純化的OmpF蛋白。

M：蛋白質分子標準質量; 1：未誘導菌株; 2：IPTG誘導菌株; 3：純化的OmpF蛋白M：Protein marker; 1：Uninduced strain; 2:IPTG induced strain; 3:Purified OmpF protein圖3 大腸桿菌OmpF蛋白的表達與純化 Fig.3 Expression and purification of recombinant E.coli OmpF protein

2.3 大腸桿菌OmpF蛋白表達菌株的最適培養(yǎng)條件

對大腸桿菌OmpF蛋白表達菌株的培養(yǎng)條件進行正交試驗探索，如表3所示獲得OmpF蛋白菌株在600 nm處的OD值后，用SPSS 21.0對其進行極差分析顯示，對OmpF蛋白表達菌株生長的影響由大到小為裝液量>轉速>葡萄糖濃度，以培養(yǎng)基的裝液量為50 mL、葡萄糖濃度為0、搖床轉速為230 r/min條件下，OmpF蛋白表達菌株的量最高(表4)，表明該條件為OmpF蛋白的最佳表達條件。此外，方差分析結果表明，3個因子均達到極顯著水平，表明這些因子對重組表達菌株的生長均起到重要作用(表5)。

表3 大腸桿菌OmpF蛋白表達菌株的培養(yǎng)結果 Tab.3 The results of 3 experiment for culture of E.coliOmpF protein expressing strain

表4 大腸桿菌OmpF蛋白表達菌株培養(yǎng)條件的極差分析 Tab.4 The range results for culture condition of E.coli OmpF protein expressing strain

表5 大腸桿菌OmpF蛋白表達菌株培養(yǎng)條件的方差分析 Tab.5 The variance results for culture condition of E.coli OmpF protein expressing strain

注：**表示相對于對照組，達到了極顯著水平(P<0.01),表8同。

Note：** means the difference with control group is significant (P<0.01).The same as Tab.8.

2.4 大腸桿菌OmpF蛋白表達菌株的誘導條件

如圖4所示，將3次重復試驗收集到的OmpF蛋白表達菌株進行SDS-PAGE電泳表明，不同誘導條件下的OmpF蛋白表達量存在差異。如表6所示，對電泳圖譜蛋白條帶進行光密度值分析表明，相同誘導條件下的OmpF蛋白表達量值重復性較高。對光密度值進行極差分析表明，在添加IPTG誘導菌體后，當菌液OD600為0.5時，添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，于28 ℃誘導8 h，OmpF蛋白的表達量最高，且在4個影響因子中，誘導時間對OmpF蛋白表達的影響最大，其次為誘導溫度，再次是IPTG誘導菌液OD600值，最后為IPTG濃度(表7)。此外，方差分析結果顯示，添加IPTG誘導時的誘導溫度及誘導時間對OmpF蛋白表達的影響達到極顯著水平(表8)。

M:蛋白質分子質量標準；1:陰性對照；2—4:OD600值為0.5時，誘導溫度分別為28、32、37 ℃；5—7:OD600值為0.8時，誘導溫度分別為28、32、37 ℃；8—10:OD600值為1.0時，誘導溫度分別為28、32、37 ℃M:Protein marker； 1:Negative control; 2—4:OD600 value of 0.5,inducing temperatures were 28,32,37 ℃, respectively; 5—7:OD600 value of 0.8,inducing temperatures were 28,32,37 ℃,respectively; 8—10:OD600 value of 1.0,inducing temperature were 28,32,37 ℃,respectively圖4 正交試驗獲得的大腸桿菌OmpF蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE analysis of E.coli OmpFprotein from orthogonal experiment

部分試驗編號Partial Test number試驗組光密度(×106)Experimental group optical density value123均值±標準差(×106)Average±Standard deviationE1F1G1H11.0441.3551.1171.172±0.163E1F2G2H21.2051.4161.8241.482±0.315E1F3G3H31.3790.9791.2691.209±0.207E2F1G2H31.1961.1221.2271.182±0.054E2F2G3H11.3121.2311.5421.362±0.161E2F3G1H20.8330.5690.9240.775±0.184E3F1G3H21.4441.2761.4381.386±0.095E3F2G1H30.6060.9660.6880.753±0.189E3F3G2H11.5161.4981.4951.503±0.011

2.5 Western blotting檢測大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體的特異性

如圖5所示，純化的OmpF蛋白多克隆抗體通過免疫印跡反應產(chǎn)生單一且清晰的條帶，表明獲得的OmpF蛋白多克隆抗體具有高度特異性。

表7 大腸桿菌OmpF蛋白表達圖數(shù)據(jù)的極差分析Tab.7 The range results of E.coli OmpFprotein expressing map data

表8 大腸桿菌OmpF蛋白表達圖數(shù)據(jù)的方差分析Tab.8 The variance results of E.coli OmpFprotein expressing map data

1:陰性對照(1∶400倍稀釋的血清)；2:1∶400倍稀釋的抗血清1:Negative control (dilution proportion of antibodies was 1∶400); 2:Dilution proportion of antibodies was 1∶400圖5 Western blotting檢測大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體的特異性Fig.5 Identification of the specificity of E.coli OmpFpolyclonal antibodies by Western blotting

2.6 大腸桿菌OmpF蛋白進化關系分析

如圖6所示，用DNAMAN 8.0軟件對12種致病菌的OmpF蛋白序列進行比對表明，曼氏假單胞菌、惡臭假單胞菌和嗜水氣單胞菌這3種細菌具有最高的同源性；除去這3種菌，其他細菌也具有較高的同源性，可能是由于OmpF蛋白的功能在這些細菌中具有相似性。如圖7所示，通過MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹顯示，大腸桿菌與沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、黏質沙雷氏菌存在較近的親緣關系，其產(chǎn)生的特異性抗體，可能對親緣關系較近細菌的感染存在交叉免疫保護作用。

圖6 大腸桿菌OmpF蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.6 Homology analysis for amino acid sequence of E.coli OmpF

圖7 MEGA 5.0軟件構建的大腸桿菌OmpF氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogentic tree based on E.coli OmpF amino acid sequences by MEGA 5.0

2.7 大腸桿菌OmpF蛋白作用網(wǎng)絡分析

如圖8所示，通過String方法對大腸桿菌OmpF蛋白進行預測可知，大腸桿菌OmpF蛋白與10種蛋白質存在相互作用，其中tut蛋白、lamB蛋白、tsx蛋白與OmpF蛋白作用更為緊密。

圖8 大腸桿菌OmpF相互作用蛋白質預測Fig.8 Protein-protein interaction prediction of E.coli OmpF protein

3 結論與討論

致病性大腸桿菌可分為腸致病性、腸產(chǎn)毒性、腸侵襲性、腸出血性、腸黏附性和彌散黏附性大腸桿菌，是臨床感染中的主要病原體[20]。目前，臨床上主要采用抗生素防治大腸桿菌病，但極易出現(xiàn)耐藥性。對大腸桿菌引起的疾病尚無理想的疫苗來預防，開發(fā)蛋白質疫苗并研究其耐藥機制是預防和控制大腸桿菌病的最有效途徑之一[10]。

多克隆抗體以其成本低、周期短及效果好而應用廣泛[21]，且使用原核表達蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體是最為常見的方法之一[22]。本研究利用純化蛋白制備了特異性較好的大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體，為研究大腸桿菌OmpF蛋白的生物學功能與相關疫苗開發(fā)提供了良好的生物學基礎材料。

本研究探索了大腸桿菌OmpF蛋白菌株的培養(yǎng)條件和表達條件。結果表明，在未誘導時，培養(yǎng)基裝液量為50 mL，不添加葡萄糖，搖床轉速230 r/min時菌株表達水平最高；培養(yǎng)基中添加IPTG誘導時，菌液OD600為0.5，添加0.1 mmol/L的IPTG，誘導時間和誘導溫度分別為8 h和28 ℃時，OmpF蛋白表達量最高。研究發(fā)現(xiàn)，轉速較高或裝液量較小，培養(yǎng)基中的溶氧濃度較大，有利于菌的生長[17]。此外，當菌體處于對數(shù)生長中期，菌體活性較高，生長代謝能力強，蛋白質合成旺盛[23]，此時加入IPTG誘導利于大量表達OmpF蛋白，與本試驗在600 nm波長處吸光度為0.5時添加IPTG結果一致。IPTG對細菌有毒性，高濃度的IPTG會影響細菌的生長和蛋白質的表達[24]，本研究進一步證實添加低濃度的IPTG，利于OmpF蛋白的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，降低菌體的生長溫度，利于活性蛋白的表達，可有效減少不溶性包涵體的形成[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)低溫利于OmpF蛋白的表達。適度的誘導時間，不僅更有利于融合蛋白的表達[26-27]，而且降低了成本，這與本研究結果一致。本研究為大量獲得OmpF蛋白用于其功能研究奠定了基礎。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)多種細菌OmpF蛋白具較高的同源性，表明這些種類細菌中OmpF蛋白參與的抗生素耐藥機制可能相近；OmpF蛋白產(chǎn)生的抗體，可能為多種細菌感染提供交叉免疫保護作用，從而實現(xiàn)單次免疫OmpF蛋白同時抵御不同種細菌的感染，為開發(fā)廣譜抑菌的OmpF蛋白疫苗制劑提供了依據(jù)。