楊躍華

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“中茶108”誘變育種的實(shí)踐和體會(huì)

楊躍華

（美國(guó)西雅圖 WA98101）

通過(guò)對(duì)茶樹的物理誘變，化學(xué)誘變及理化復(fù)合誘變的系統(tǒng)研究, 提出了適宜于茶樹的誘變技術(shù)及其技術(shù)指標(biāo)。明確了茶樹體內(nèi)自由基及咖啡堿、兒茶素等次生代謝產(chǎn)物含量與輻照損傷、輻照致敏的關(guān)系，探討了茶樹體內(nèi)DNA輻照損傷的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了微核細(xì)胞率作為預(yù)測(cè)茶樹輻照損傷的鑒定指標(biāo)。成功地誘變選育出國(guó)內(nèi)首個(gè)應(yīng)用輻照誘變育種技術(shù)育成的國(guó)家茶樹品種——“中茶108”。

茶樹育種； 誘變育種；“中茶108”；誘變技術(shù)；新品種選育

茶樹是多年生作物，自然突變率低，育種周期長(zhǎng)，為了擴(kuò)大突變譜，提高育種效率，1986年開始，我在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所育種研究室，現(xiàn)后主持了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(原農(nóng)業(yè)部)“七五”(1986～1990)重點(diǎn)課題“茶樹人工誘變技術(shù)研究”和“八五”(1991～1995)重點(diǎn)課題“茶樹育種新技術(shù)”研究。帶領(lǐng)著課題組對(duì)茶樹的物理誘變，化學(xué)誘變及理化復(fù)合誘變進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，成功地誘變選育出國(guó)內(nèi)首個(gè)應(yīng)用輻照誘變育種技術(shù)育成的國(guó)家茶樹品種——中茶“108”。本文對(duì)我們獲得的茶樹誘變技術(shù)及中茶108誘變育種進(jìn)行總結(jié)，為今后的茶樹誘變育種研究提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

誘變技術(shù)研究供試材料來(lái)自云南、廣東、江西、湖南、安徽、四川、浙江7個(gè)產(chǎn)茶省的17個(gè)品種的茶籽及6個(gè)品種插穗。

1.2 輻照處理

種籽輻照劑量0，9.3，18.6，27.9，37.2 和 55.9Gy，劑量率0.56Gy/min。插穗輻照劑量為0，5.7，9.5，13.3，17.1，20.9，28.5Gy。劑量率為0，0.29，0.57，0.86，1.14，1.43 Gy/min。輻照后立即播種扦插并調(diào)查成株率，苗高，葉片及根系生長(zhǎng)情況。

1.3 理化復(fù)合處理

將茶籽和插穗先進(jìn)行60Co輻照處理，種籽輻照劑量0，9.3，18.6，27.9，37.2 和 55.9Gy，插穗輻照劑量為0，5.7，9.5，13.3，17.1，20.9，28.5Gy。劑量率0.56Gy/min，然后分別浸泡于濃度為0, 0.2%和1.0%的DES中處理24h和48h，取出茶籽和插穗用流水沖洗干凈后播種扦插，調(diào)查項(xiàng)目同上。

1.4 生理生化測(cè)定

核酸及DNA，RNA的含量分析按“植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”[1]中的方法。微核細(xì)胞率及染色體畸變率按陶舜華等[2]介紹的方法稍加改進(jìn)。其他生理，生化項(xiàng)目均參照“茶葉生理生化實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”[3]介紹的方法測(cè)定。

2 實(shí)踐與體會(huì)

2.1 茶樹的輻照誘變效應(yīng)及適宜劑量指標(biāo)

首先，我們對(duì)茶樹的物理誘變進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在物理誘變育種研究上，我們主要利用60Co( 鈷60)γ射線對(duì)茶樹的穗條和種籽進(jìn)行輻照處理。輻照處理后的茶樹活體材料，必須及時(shí)扦插播種。然后對(duì)誘變插穗和茶籽的生長(zhǎng)變化進(jìn)行了密切的田間觀察和測(cè)量，對(duì)茶樹的品質(zhì)成分，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理指標(biāo)進(jìn)行了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)室分析。研究表明，當(dāng)輻照劑量維持在半致死劑量左右時(shí)，茶樹的有效突變率較高。通過(guò)對(duì)來(lái)自9個(gè)主要產(chǎn)茶省17個(gè)品種茶籽及插穗的系統(tǒng)誘變研究，我們獲得了不同品種輻照的半致死劑量（表1）， 進(jìn)而提出了茶樹輻照的誘變效應(yīng)和適宜技術(shù)指標(biāo): 即輻照劑量率在0.57～0.86Gy/min的范圍內(nèi)效果比較明顯。插穗的適宜輻照劑量為5.7～9.5Gy；灌木型中小葉種茶籽適宜輻照劑量為27.9～37.2Gy，喬木型大葉種茶籽適宜輻照劑量為9.3～21Gy[4]。

2.2 茶樹理化復(fù)合誘變效應(yīng)及適宜的劑量指標(biāo)

在化學(xué)誘變處理研究中， 我們研究了化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯(DES)和甲基硫酸乙酯(EMS)對(duì)茶樹的誘變效應(yīng)。我們還首次研究了理化復(fù)合處理對(duì)茶樹的誘變效應(yīng)，提出理化復(fù)合處理對(duì)茶樹的誘變有“共軛增效”作用。通過(guò)對(duì)不同品種茶籽及插穗的理化復(fù)合誘變研究，我們提出了茶樹理化復(fù)合誘變效應(yīng)和適宜技術(shù)指標(biāo)(表2): 即喬木型大葉種茶籽適宜輻照劑量為9.3～18.6Gy；硫酸二乙酯，甲基硫酸乙酯的處理濃度為0.2%；灌木型中小葉種茶籽適宜輻照劑量為20～37Gy，硫酸二乙酯，甲基硫酸乙酯的處理濃度為0.2～1.0%[5][5, 6]。

表1 不同品種茶籽及插穗輻照的半致死劑量

表2 不同品種復(fù)合處理M1代成株率調(diào)查

2.3 茶樹輻照損傷的生理機(jī)制

通過(guò)對(duì)輻照茶樹葉片中DNA含量的測(cè)定， 我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)插穗受到輻照處理后，葉片中DNA含量是隨著輻照劑量的增大而下降。茶樹體內(nèi)DNA的損傷主要是發(fā)生單鏈斷裂，進(jìn)而導(dǎo)DNA致的解聚。不同品種茶樹的輻照敏感性與其DNA含量的關(guān)系不明顯，但與DNA下降的幅度密切相關(guān)[6]。

我們的研究表明，當(dāng)茶籽受到輻照處理后，隨著輻照劑量的增加， 茶籽內(nèi)自由基含量逐漸增大，從而誘導(dǎo)體內(nèi)DNA等生物大分子的損傷和畸變。在同一劑量處理下輻照自由基增加趨勢(shì)表現(xiàn)為喬木型大葉品種大于灌木型中小葉品種，這一結(jié)果是與茶樹品種類型輻射敏感性的變化趨勢(shì)相一致的。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)各品種茶籽內(nèi)兒茶素(x1)，茶多酚類(x2)， 咖啡堿(x3)， 黃酮苷(x4)， 自由基(x5)與輻射半致死劑量(y)關(guān)系的研究，獲得了多元回歸方程：

y=62.37-3.96x1+2.99x2-4.39x3-1.39x4-3.90x5(<0.05)

說(shuō)明上述特異成分對(duì)茶樹的輻射敏感性均有不同成度的影響，利用逐步回歸法進(jìn)一步分析表明，在F0.01水平下，回歸方程是：

y=59.14-8.49x1-3.10x5.

這表明兒茶素和自由基是影響茶樹輻射敏感性的主要因素[7]。

通過(guò)對(duì)輻照插穗芽尖細(xì)胞的微核變化的研究表明，當(dāng)各品種插穗插穗輻照后，芽尖細(xì)胞中的微核細(xì)胞率是隨著輻照的劑量增加而增大，其品種的輻照敏感性與微核細(xì)胞率變化的幅度一致的。而且茶樹受到輻照處理后，各品種的染色體畸變率與其微核細(xì)胞率均呈高度正相關(guān)。微核細(xì)胞率可以作為預(yù)測(cè)茶樹品種輻照敏感性的一個(gè)指標(biāo)[6]。

2.4 中茶108誘變育種的實(shí)施

茶樹誘變技術(shù)及技術(shù)指標(biāo)的建立，使我們的誘變育種有了可靠的技術(shù)依據(jù)。隨后，我們采取大批量，多批次的方法，在適宜的誘變劑量范圍內(nèi)對(duì)插穗和茶籽實(shí)施了多批次誘變處理。鑒于茶葉生產(chǎn)和市場(chǎng)對(duì)早生優(yōu)質(zhì)綠茶品種的需求強(qiáng)烈， 我們的誘變育種方向也向早生優(yōu)質(zhì)綠茶品種方面?zhèn)戎?。首先，我們?cè)谡T變處理的選材上，重點(diǎn)選用已有的早生優(yōu)質(zhì)綠茶品種的插穗和種籽進(jìn)行誘變處理，以期在早生優(yōu)質(zhì)方面上獲得新的突破。我們對(duì)龍井43、黃葉早、烏牛早、福鼎大白茶等品種的插穗和種籽進(jìn)行誘變處理。1989我們?cè)趯?duì)誘變材料的田間觀察和研究中，篩選出1個(gè)生物學(xué)性狀突出的單株，命名為96號(hào)。該單株是從龍井43品種的插穗經(jīng)9.5戈瑞輻照處理的誘變材料中篩選出來(lái)。連續(xù)兩年的研究發(fā)現(xiàn)，它比龍井43對(duì)照品種提早萌芽2天，茶苗的高幅度，分枝數(shù)及常規(guī)品質(zhì)成分等經(jīng)濟(jì)性狀也顯著高于對(duì)照品種(表3， 表4)。其96號(hào)誘變單株就是后來(lái)育成的中茶108號(hào)國(guó)家良種。此后，我們又陸續(xù)誘變、篩選出了另外62個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀突出的誘變單株。

表3 誘變株系的主要經(jīng)濟(jì)性狀

表4 誘變株系新梢品質(zhì)成分的變化(%)

“八五”(1991～1995)期間，我們對(duì)96號(hào)等誘變株系繼續(xù)進(jìn)行株系鑒定和無(wú)性繁殖。根據(jù)株系鑒定實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，96號(hào)被重新命名為輻II (即后來(lái)的中茶108)。通過(guò)輻II等生物學(xué)特征及常 規(guī)品質(zhì)成分的株系鑒定結(jié)果，在1993年秋我?guī)ьI(lǐng)課題組規(guī)劃設(shè)計(jì)并布置了對(duì)輻II(原名96號(hào))等8個(gè)誘變品系的田間品比試驗(yàn)。我們系統(tǒng)地開展了對(duì)輻II等品系與對(duì)照品種福鼎大白茶的生物學(xué)特征、品質(zhì)成分等經(jīng)濟(jì)性狀的比較試驗(yàn)。分析檢測(cè)了輻II等品系生育期、產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性等特征與對(duì)照品種福鼎大白茶的差異。進(jìn)一部確定了輻II號(hào)具有發(fā)芽早，產(chǎn)量高，常規(guī)品質(zhì)成分含量(特別是氨基酸的含量)高，酚氨比合理等優(yōu)點(diǎn)。1995年“茶樹育種新技術(shù)”課題和輻II等優(yōu)良誘變品系順利地通過(guò)了農(nóng)業(yè)部組織的專家驗(yàn)收?！鞍宋濉敝?，在育種研究室其他同事們的共同努力下，進(jìn)一步補(bǔ)充完善了輻II品比試驗(yàn)的調(diào)查結(jié)果，完成了后續(xù)的區(qū)域性試驗(yàn)，明確了其適宜推廣種植的區(qū)域。輻II也正式被命名為中茶108號(hào)，于2010年通過(guò)了全國(guó)茶樹品種鑒定委員會(huì)鑒定，成為國(guó)內(nèi)首個(gè)應(yīng)用輻照誘變育種技術(shù)育成的國(guó)家茶樹品種[8]。研究和試驗(yàn)推廣結(jié)果表明，種植中茶108的增產(chǎn)增效作用十分顯著，受到了廣大適種茶區(qū)的熱烈歡迎?，F(xiàn)已被浙江、四川、湖北等省列為主推品種之一。

2.5 “中茶108”誘變育種的體會(huì)

回顧我在中茶108誘變育種的經(jīng)歷，使我深深的體會(huì)到，創(chuàng)新是科研發(fā)展的動(dòng)力，是茶學(xué)研究突破的發(fā)動(dòng)機(jī)。在中茶108誘變育種研究中，首先，我們緊緊抓住創(chuàng)新這一核心，研究發(fā)現(xiàn)了適宜于茶樹的誘變技術(shù)及其技術(shù)指標(biāo)。明確了茶樹體內(nèi)自由基及咖啡堿、兒茶素等次生代謝產(chǎn)物含量與輻照損傷、輻照致敏的關(guān)系[7]，確定了茶樹體內(nèi)DNA輻照損傷的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了微核細(xì)胞率作為預(yù)測(cè)茶樹輻照損傷的鑒定指標(biāo)。 這就為我們開展進(jìn)一步的茶樹誘變育種提供了技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。同時(shí)，我們誘變育種的目標(biāo)明確，以早生優(yōu)質(zhì)為誘變育種的攻關(guān)目標(biāo)。所以說(shuō)，誘變選育出中茶108新品種也絕非偶然，并不是靠碰運(yùn)氣碰出來(lái)的，而是長(zhǎng)期堅(jiān)持研究的成果。隨著科學(xué)技術(shù)研究的發(fā)展和進(jìn)步，茶樹基因圖譜及DNA融合技術(shù)的建立，使得茶樹分子育種、定向育種逐漸成為可能。相信茶葉育種科研人員能再接再勵(lì)，選育出更多更好的新品種來(lái)。

[1]薛應(yīng)龍主編；上海植物生理學(xué)會(huì)編. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1985.

[2]陶舜華, 張伯林. ~(60)Coγ輻射誘發(fā)大麥根尖細(xì)胞染色體畸變類型及頻率與劑量的關(guān)系[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 1984, (04): 1-6+13.

[3]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所著. 茶樹生理及茶葉生化實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社, 1983.

[4]楊躍華, 林樹祺. 茶樹人工誘變技術(shù)的研究 Ⅰ.茶樹輻照的生物學(xué)效應(yīng)[J]. 茶葉科學(xué), 1990, (01): 19-24.

[5]楊躍華, 林樹祺. 茶樹人工誘變技術(shù)的研究——Ⅱ.理化復(fù)合處理對(duì)茶樹的生物學(xué)效應(yīng)[J]. 茶葉科學(xué), 1990, (02): 47-52.

[6]楊躍華, 林樹祺. 茶樹人工誘變技術(shù)的研究 Ⅳ.茶樹輻照損傷的生理機(jī)制[J]. 茶葉科學(xué), 1991, (01): 19-24.

[7]楊躍華，林樹祺，孫濤，程后坤. 茶樹特異成分對(duì)輻照誘導(dǎo)自由基的作用[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 1994, (04): 209-215.

[8]陳宗懋主編. 中國(guó)茶經(jīng)[M]. 上海：上海文化出版社, 1992.

[9]楊躍華, 林樹祺. 茶樹人工誘變技術(shù)的研究——Ⅲ.不同品種茶樹的輻照敏感性[J]. 茶葉科學(xué), 1990, (02): 53-58.

2018-12-03

S571.1

A

1006-5768（2019）01-015-05

（責(zé)任編輯：蔣文倩）