祝 磊 李炳強(qiáng) 陳 晨

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，石河子 832000)

結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率分別占全身惡性腫瘤的第3位和第4位，全球每年有120萬(wàn)新發(fā)病例，超過(guò)60萬(wàn)死亡病例，嚴(yán)重威脅患者的生命安全和生活質(zhì)量[1]。結(jié)腸癌的臨床治療方案主要為手術(shù)切除為主聯(lián)合放療、化療的綜合療法，因結(jié)腸癌早期缺乏特異性表現(xiàn)，多數(shù)患者診斷時(shí)已處于中晚期，化療是主要治療方式，5年生存率不足40%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響療效的主要因素[2]。尋找新的治療方法和策略，改善結(jié)腸癌治療效果成為臨床研究的熱點(diǎn)，基因治療是癌癥治療的新理念，明確影響結(jié)腸癌發(fā)病和進(jìn)展的生物學(xué)、基因?qū)W特點(diǎn)可為基因?qū)W治療和預(yù)后改善提供新證據(jù)[3]。miRNA-145是位于人染色體5q32-33的小分子RNA，卵巢癌、前列腺癌、食管癌等癌旁組織均可見(jiàn)miRNA-145表達(dá)，它具有阻止細(xì)胞癌變和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，miRNA-145表達(dá)的變化對(duì)腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、凋亡等均有一定影響，但在結(jié)腸癌中的研究較少[4-5]。本研究將人工化學(xué)合成的miRNA-145擬似物和阻遏物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，探討miRNA-145對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自武漢科昊佳生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；MTT、Transwell小室購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司；分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、PCR儀購(gòu)自美國(guó)HACH公司；化學(xué)法合成miRNA-145擬似物、阻遏物和陰性對(duì)照物、miRNA擬似物、阻遏物、陰性對(duì)照物合成、測(cè)序均由大連寶公司進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞以1×106ml-1的密度培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天更換培養(yǎng)液。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，胰酶消化后1 000×g離心2min，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105ml-1，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 ml細(xì)胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，共分為4組，即空白對(duì)照組(Blank control group，BC組)只轉(zhuǎn)染試劑，陰性對(duì)照組(Negative control group，NC組)轉(zhuǎn)染miRNA145陰性對(duì)照物，miRNA145擬似物轉(zhuǎn)染組(Mimetic transfection group，MT組)轉(zhuǎn)染miRNA145擬似物，miRNA145阻遏物轉(zhuǎn)染組(Repressor transfection group，RT組)轉(zhuǎn)染miRNA145阻遏物，轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectamine 2000說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3HCT116增殖活性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h，胰酶消化法制備HCT116細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度1×105ml-1，每孔含1×104個(gè)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，接種后24 h、48 h、72 h每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入100 μl DMSO溶解沉淀，震動(dòng)混勻沉淀15 min，酶標(biāo)儀比色，記錄490 nm處吸光度值。

1.2.4轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miRNA-145表達(dá)檢測(cè) 與MTT檢測(cè)同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞樣本，采用6孔板接種密度2×105個(gè)/孔，酚氟仿法抽取RNA，取2 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，熒光定量法檢測(cè)miRNA-145含量，反應(yīng)條件：95℃變性10 s，58℃退火10 s ，72℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)設(shè)置為40。引物序列：miRNA-145：上游：5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游：5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′；內(nèi)參(RTU6)：上游：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游：5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′。2-ΔΔCt法分析定量結(jié)果。

1.2.5Transwell小室法檢測(cè)HCT116細(xì)胞侵襲 取轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞1×105ml-1，接種于Transwell板上室，每孔160 μl，加入20%ASPS血清40 μl，800 μl RMPI1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)基底膜下室細(xì)胞數(shù)，采用在400×顯微鏡下隨機(jī)選取中央和上下左右5個(gè)視野的穿越基底膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.2.6Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染72 h后HCT116細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500 μl Binding Buffer懸浮，再加入5 μl Annexin V-FITC混勻，最后加入5 μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)10 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1HCT116增殖活性比較 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h時(shí)擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性顯著低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和阻遏物轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，阻遏物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性顯著高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和擬似物轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2HCT116細(xì)胞內(nèi)miRNA-145表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)擬似物轉(zhuǎn)染組miRNA-145表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和阻遏物轉(zhuǎn)染組，阻遏物轉(zhuǎn)染組miRNA-145表達(dá)顯著低于擬似物轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組miRNA-145表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 HCT116增殖活性比較Fig.1 Comparison of HCT116 proliferation activity

圖2 HCT116細(xì)胞內(nèi)miRNA-145表達(dá)Fig.2 Expression of miRNA-145 in HCT116 cells

2.3HCT116細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果顯示，擬似物轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和阻遏物轉(zhuǎn)染組，阻遏物轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和擬似物轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4HCT116細(xì)胞凋亡水平相比較 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和阻遏物轉(zhuǎn)染組，阻遏物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和擬似物轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 HCT116細(xì)胞侵襲能力比較Fig.3 Comparison of the invasiveness of HCT116 cells

圖4 HCT116細(xì)胞凋亡水平相比較Fig.4 Comparison of HCT116 cell apoptosis level

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展是多步驟、多因素的進(jìn)行性過(guò)程，詳細(xì)機(jī)制尚未完全闡明，探討其發(fā)病機(jī)制有助于對(duì)其有更深入的了解，并有助于指導(dǎo)臨床治療。miRNA為高保守、高組織特異性且無(wú)蛋白編碼的小分子RNA，是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因，參與諸多生理病理過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。miRNA-145長(zhǎng)度約4.08 kb，可通過(guò)調(diào)控IRS-1、IGF-IR、C-myc、RTKN、ERBB、BNIP3、YES、STAT1、EGFR、MUC-1等靶基因影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、侵襲、凋亡等過(guò)程[7]。

近年來(lái)的研究顯示，miRNA-145在前列腺癌、胃癌、喉癌、腎癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中均表現(xiàn)為水平下調(diào)，提示正常機(jī)體中miRNA-145可能抑制原癌基因激活，miRNA-145功能受到抑制可能是原癌基因激活的重要原因[8-13]。王丹等[14]研究顯示，miR-145與Sp1在肺腺癌A549細(xì)胞中表達(dá)呈顯著相關(guān)性，miR-145異常表達(dá)可能是Sp1基因表達(dá)的關(guān)鍵原因，miR-145可能通過(guò)對(duì)Sp1表達(dá)的調(diào)控影響A549細(xì)胞生物學(xué)行為。趙一奇等[15]研究認(rèn)為，miR-145可下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移基因Mucl，沉默Mucl表達(dá)，調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，可能是臨床腫瘤治療的潛在手段。

本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miRNA-145擬似物和阻遏物至HCT116細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)顯示擬似物轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞miRNA-145表達(dá)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著升高，而阻遏物轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞miRNA-145表達(dá)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著降低。抑制miRNA-145表達(dá)則增強(qiáng)HCT116細(xì)胞增殖、侵襲活性、降低腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)miRNA-145表達(dá)則可降低HCT116細(xì)胞增殖、侵襲活性和增加腫瘤細(xì)胞凋亡。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)提示，miRNA-145表達(dá)異常是影響HCT116細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡重要因素，這為新的基因靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)提供了思路。