不同級別蛹蟲草子實(shí)體菌粉對免疫低下小鼠非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用比較

馬淑梅，陳 瑤，顏仁杰，王佳慧，劉 莉

(1. 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評價(jià)研究中心，2. 上海市生物物質(zhì)成藥性評價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，3. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200437)

蛹蟲草俗稱北蟲草，主要含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、治療腎損傷、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖等功效[1-4]。Cunningham等[5]首次從蛹蟲草中提取到蟲草素，并確定其結(jié)構(gòu)為3-脫氧腺苷。研究表明，蟲草素能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ，激活自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷吞噬活性，從而提高機(jī)體非特異性免疫功能[6]。

蛹蟲草提取精制過程中，提取溫度和提取次數(shù)均會影響蟲草素的得率。因此，本研究中將不同人工培植方法得到的兩種蟲草子實(shí)體——超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草，直接經(jīng)粉碎機(jī)制備成蟲草子實(shí)體菌粉，經(jīng)HPLC(NYT/2116-2012)分析測試發(fā)現(xiàn)，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實(shí)體菌粉的蟲草素含量分別為1.07×104mg·kg-1和1.41×103mg·kg-1，超Ⅴ星蟲草子實(shí)體菌粉中蟲草素的含量為Ⅰ星蟲草含量的7.6倍。本文通過檢測免疫低下小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬、自然殺傷細(xì)胞殺傷活性、細(xì)胞因子分泌水平等，分析比較了超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實(shí)體菌粉對機(jī)體非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞株SPF級♂BALB/c小鼠50只，體質(zhì)量(18～20) g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016。小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2藥物與試劑蛹蟲草子實(shí)體-超Ⅴ星(批號S160321P-0，深褐色粉末)、蛹蟲草子實(shí)體菌粉-Ⅰ星(批號S170603，淺黃色粉末)，均由常德炎帝生物工程有限公司提供；蛹蟲草菌粉膠囊(吉林省中晟制藥有限公司，批號20160101)；地塞米松磷酸鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號1705252111)。刀豆球蛋白A(ConA，Sigma，批號SLBM9735V)；脂多糖(LPS，Sigma，批號011M4001V)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20180113)；小鼠白介素2(interleukin 2，IL-2)ELISA試劑盒(批號K25031872)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號Q15031805)，均購自武漢華美生物工程有限公司；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)，批號01/2018)。

1.3儀器Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀、Legend Micro 21R離心機(jī)、370 Series二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；GI54DWS(50L)全自動高壓滅菌鍋(Zealway公司)；5810R高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；NIB-100普通倒置顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司)。

1.4模型的制備及分組給藥50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、超Ⅴ星蟲草(1 g·kg-1)組、Ⅰ星蟲草(1 g·kg-1)組和蟲草膠囊(陽性藥，1 g·kg-1)組。動物分組后，持續(xù)給藥28 d，給藥體積為10 mL·kg-1體質(zhì)量，對照組和模型組灌胃給予等體積的飲用水。除對照組外，其余各組于實(shí)驗(yàn)d 22、23腹腔注射地塞米松20 mg·kg-1，期間每周稱量動物體質(zhì)量。末次給藥后24 h稱重，以各組解剖當(dāng)日體質(zhì)量減去地塞米松造模前體質(zhì)量計(jì)算體質(zhì)量變化值；取血，測血常規(guī)；頸椎脫臼處死動物后解剖，取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.5巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)用DMEM完全培養(yǎng)液將腹腔巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)至1×109·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。棄上清，每孔加DMEM完全培養(yǎng)液100 μL，再加1 g·L-1的中性紅水溶液100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。棄上清，用PBS沖洗3次，加細(xì)胞裂解液過夜，酶標(biāo)儀于540 nm波長下測OD值。

1.6自然殺傷(naturalkiller，NK)細(xì)胞殺傷活性測定用含5 g·L-1牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，將脾淋巴細(xì)胞調(diào)至2.5×1010·L-1作為效應(yīng)細(xì)胞，用含5 g·L-1BSA的RPMI 1640培養(yǎng)液將YAC-1細(xì)胞調(diào)節(jié)至5×108·L-1作為靶細(xì)胞；向96孔板中分別加入100 μL效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞=50 ∶1)懸液，自然釋放孔加100 μL的靶細(xì)胞和100 μL含5 g·L-1BSA的RPMI 1640培養(yǎng)液，最大釋放孔加100 μL的靶細(xì)胞和100 μL 0.2%的NP-40裂解液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；低溫離心取上清；按照LDH測定試劑盒說明書測定細(xì)胞上清液的LDH活性。

NK細(xì)胞殺傷活力=(實(shí)驗(yàn)孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100%

1.7脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平檢測用RPMI 1640完全培養(yǎng)液將脾淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)至1×109·L-1，取24孔培養(yǎng)板，每孔加入0.5 mL含ConA(終濃度5 mg·L-1)的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，離心取上清，用ELISA法測定上清中IL-2的含量。

1.8腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-6水平的檢測用DMEM完全培養(yǎng)液將腹腔巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)至1×109·L-1，在24孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.5 mL小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液，2 h后棄上清，每孔加入0.5 mL含LPS(終濃度10 mg·L-1)的培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取上清，用ELISA法測定上清中TNF-α、IL-6的含量。

2 結(jié)果

2.1超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實(shí)體菌粉對免疫低下小鼠體質(zhì)量變化的影響Tab 1結(jié)果顯示，d 22造模后，各組小鼠體質(zhì)量均降低，模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降，毛色無華，精神萎靡。與模型組比較，Ⅰ星蟲草、超Ⅴ星蟲草與蟲草膠囊均可明顯拮抗地塞米松造成的體質(zhì)量下降，Ⅰ星蟲草和超Ⅴ星蟲草比較差異無顯著性。但在體質(zhì)量恢復(fù)的趨勢上，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。

2.2超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實(shí)體菌粉對免疫低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響胸腺和脾臟都是機(jī)體質(zhì)量要的免疫器官，前者是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場所，后者是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，兩者的臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。由Tab 1可見，采用地塞米松造模后，模型小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯下降，與模型組相比，Ⅰ星蟲草、超Ⅴ星蟲草與蟲草膠囊均明顯拮抗地塞米松造成的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)下降。在拮抗由地塞米松所導(dǎo)致的胸腺指數(shù)下降方面，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性，但在胸腺指數(shù)恢復(fù)的趨勢上，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。在拮抗由地塞米松所導(dǎo)致的脾臟指數(shù)下降方面，超Ⅴ星蟲草明顯強(qiáng)于Ⅰ星蟲草。

2.3超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實(shí)體菌粉對免疫低下小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響如Fig 1所示，采用地塞米松造模后，模型小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，中性粒細(xì)胞百分率明顯升高，淋巴細(xì)胞百分率明顯降低。超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗由地塞米松所導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞百分率升高，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性；超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗由地塞米松所導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞百分率降低，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草相比有顯著性差異。

2.4超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響由Fig 2可知，用地塞米松造模的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯降低，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗該變化，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性，但增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。超Ⅴ星蟲草、Ⅰ星蟲草與蟲草膠囊比較差異均無顯著性。

Tab 1 Effect of different levels of Cordyceps militaris powder on weight change and visceral index of dexamethasone induced immunodeficiency

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsdexamethasone；△P<0.05vsⅠ star CM；▲P<0.05vscordyceps capsule

Fig 1 Effects of different levels of Cordyceps militaris on blood routine in mice after 28 days of

A:White blood cell(WBC) count. B:Percentage of neutrophilic granulocytes(NE%), C:Percentage of lymphocytes (LY%),1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone;△P<0.05vsI star CM;▲▲P<0.01vscordyceps capsule.

Fig 2 Effects of different levels of Cordyceps militaris on phagocytic activity of mice abdominal macrophages after

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdexamethasone

2.5超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠NK細(xì)胞活性的影響由Fig 3可知，用地塞米松造?？擅黠@降低NK細(xì)胞活性，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草、蟲草膠囊均可明顯拮抗該變化，且超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草相比具有顯著性差異。

2.6超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響本實(shí)驗(yàn)選擇測定IL-2水平，來觀察不同級別蟲草子實(shí)體菌粉對免疫低下小鼠T淋巴細(xì)分泌細(xì)胞因子的影響。Fig 4結(jié)果顯示，與正常對照組相比，給予地塞米松后，IL-2的生成量明顯降低，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草、蟲草膠囊都可以明顯拮抗地塞米松引起的IL-2分泌降低，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性，趨勢上超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。

Fig 3 Effect of different levels of Cordyceps militaris on NK cell killing activity in mice after 28 days of

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone;△P<0.05vsI star CM;▲▲P<0.01vscordyceps capsule

2.7超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響本實(shí)驗(yàn)選擇測定TNF-α和IL-6，觀察不同級別蟲草子實(shí)體菌粉對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。由Fig 5可知，與正常對照組相比，給予地塞米松后，TNF-α和IL-6分泌量均明顯降低，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草、陽性藥都可以拮抗地塞米松引起的TNF-α和IL-6分泌量降低；在拮抗地塞米松誘導(dǎo)的TNF-α分泌量降低方面，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草相比具有顯著性差異。

Fig 4 Effect of different levels of Cordyceps militaris on IL-2 level secreted by mouse spleen lymphocytes after

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone

Fig 5 Effects of different levels of Cordyceps militaris on TNF-α secretion and IL-6 secretion of mice abdominal macrophages after

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone;△P<0.05vsI star CM

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從體質(zhì)量、臟器指數(shù)、血常規(guī)、巨噬細(xì)胞功能測定、NK細(xì)胞活性和細(xì)胞因子分泌等多個方面，對超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草的免疫調(diào)節(jié)功效進(jìn)行了比較。對于體質(zhì)量，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草均可明顯拮抗地塞米松造成的體質(zhì)量降低，Ⅰ星蟲草和超Ⅴ星蟲草比較差異無顯著。但體質(zhì)量恢復(fù)的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。對于血常規(guī)，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗地塞米松導(dǎo)致的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞降低，以及中性粒細(xì)胞升高，對地塞米松造成的淋巴細(xì)胞百分率降低的拮抗作用，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草比較具有顯著性差異。

影響非特異性免疫功能的研究方法較多，免疫藥理實(shí)驗(yàn)常以藥物對實(shí)驗(yàn)動物免疫器官重量的影響，作為初步觀察藥物對免疫功能影響的指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體的整體免疫功能增強(qiáng)時，其質(zhì)量有所增加，臟器系數(shù)增加[7-8]。對于臟器指數(shù)，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草均明顯拮抗地塞米松造成的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)下降，對地塞米松造成的胸腺指數(shù)下降的拮抗作用，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草比較差異無顯著，但胸腺指數(shù)恢復(fù)的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。對地塞米松造成的脾臟指數(shù)下降的拮抗作用，超Ⅴ星蟲草明顯強(qiáng)于Ⅰ星蟲草。

在機(jī)體內(nèi)，巨噬細(xì)胞是其免疫系統(tǒng)的一種重要免疫細(xì)胞，具有很強(qiáng)的吞噬功能及抗原遞呈作用，對特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞通過釋放NO、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，殺滅病原微生物[9-10]。巨噬細(xì)胞吞噬力的高低，反映了機(jī)體免疫水平的高低。巨噬細(xì)胞活性強(qiáng)、吞噬力高，機(jī)體的免疫力就高。對于單核-巨噬細(xì)胞功能，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)中，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗地塞米松造成的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的降低，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草比較差異無顯著，但增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。

NK細(xì)胞是生物體內(nèi)天然存在的非特異的免疫殺傷細(xì)胞。NK細(xì)胞對T細(xì)胞、B細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞等細(xì)胞的功能均有一定的調(diào)節(jié)作用，還能夠分泌多種細(xì)胞因子，它在宿主的免疫監(jiān)視功能中起重要作用。對于NK細(xì)胞活性，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯增加NK細(xì)胞活性，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草比較具有顯著性差異。

綜上所述，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對地塞米松誘導(dǎo)的免疫功能低下的各個環(huán)節(jié)均具有明顯的改善作用，在提高脾臟指數(shù)、增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷能力、提高巨噬細(xì)胞分泌TNF-α分泌水平方面，超Ⅴ星蟲草作用明顯優(yōu)于Ⅰ星蟲草。