許禎，倪雅麗，肖曼，杜冠魁

(1 海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199;2 海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;3 海南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

糖尿病發(fā)病率呈世界性的逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，糖尿病已成為發(fā)達(dá)國(guó)家繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，糖尿病可導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官的慢性進(jìn)行性病變，給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。糖尿病腎病(DN)是嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥之一。DN早期無(wú)明顯臨床癥狀，但病情即可出現(xiàn)腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常，表現(xiàn)為腎小球高灌注和高濾過(guò),腎血流量和腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)升高，且增加蛋白攝入后各指標(biāo)升高程度更明顯[1]。近年研究[2]表明，腸道菌群的改變與肥胖、DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。終末期DN患者的腸道優(yōu)勢(shì)菌群比例失調(diào)，雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和糞桿菌屬等益菌群數(shù)量明顯減少，腸桿菌科細(xì)菌、腸球菌屬細(xì)菌等有害菌群數(shù)量明顯增多，導(dǎo)致患者血液炎癥因子水平升高，有利于體內(nèi)微炎癥狀態(tài)形成[3]。纈沙坦是一種血管緊張素Ⅱ(AT)受體拮抗劑，可降低腎小球?qū)Φ鞍椎耐ㄍ感?，延緩DN患者的腎功能衰竭[4]。但纈沙坦治療DN的具體作用機(jī)制目前尚不明確。2016年1月～2017年6月，我們觀察了纈沙坦灌胃的DN小鼠腸道菌群的變化，并分析其腸道菌群多樣性，旨在為纈沙坦治療DN的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑及儀器 7只8周齡小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量(23.62±1.35)g; 14只周齡8周雄性DN模型(db/db)小鼠,體質(zhì)量(30.28±1.47)g;購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。纈沙坦分散片(山東益健藥業(yè)有限公司)，葡萄糖測(cè)定試劑盒(葡萄糖氧化酶法)，小鼠尿白蛋白(MAU)，ELISA檢測(cè)試劑盒，小鼠尿素氮 (BUN)ELISA試劑盒酶標(biāo)儀、制冰機(jī)、冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、注射器(1 mL)、96孔酶標(biāo)板、移液搶與槍頭等。

1.2 動(dòng)物分組及頡沙坦灌胃方法 將14只db/db小鼠隨機(jī)分為A、B 兩組，A組每天纈沙坦 50 mg/kg灌胃，B組等量生理鹽水灌胃，另取7只正常小鼠為對(duì)照組，每天灌胃等量生理鹽水。三組均灌胃8周。

1.3 各組小鼠腎功能指標(biāo)觀察 灌胃后取各組小鼠，測(cè)定體質(zhì)量，尾部靜脈取血，GOD-POD法測(cè)定血糖。收集各組小鼠24 h尿液，ELISA法檢測(cè)小鼠尿素氮 (BUN)ELISA試劑盒酶標(biāo)儀測(cè)定尿白蛋白和尿素氮，采用南京建成生物工程研究所尿白蛋白試劑盒，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 各組小鼠腸道菌群種屬及其生物多樣性分析 收集各組0.2 g糞便標(biāo)本，采用QiaAmp Mini DNA-Isolation kit(德國(guó)Qiagen公司)提取細(xì)菌DNA，所有操作均嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)提取細(xì)菌DNA進(jìn)行高通量測(cè)序：以總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，引物序列為上游引物3′-GCCAGCAGCCGCGGTAA-5′；下游引物3′-CCGTCAATTYYTTTRAGTTT-5′。測(cè)序結(jié)果分析：對(duì)細(xì)菌種屬行PCoA分析，A、B組小鼠腸道菌群存在顯著的分離效應(yīng)，B組與對(duì)照組腸道菌群存在顯著區(qū)別。進(jìn)一步通過(guò)聚類分析將細(xì)菌進(jìn)行分類,除db/db2，其余6個(gè)B組小鼠腸道菌群可聚為一類；除db/db-val6，其余6個(gè)A組小鼠腸道菌群可聚為一類。測(cè)算各組小鼠腸道細(xì)菌種屬OTU指數(shù)。根據(jù)序列的相似性(本分析中閾值設(shè)定為97%)，將有效序列歸為多個(gè)操作分類單元(OTU)，并將OTU中全部序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出與之最相近且可信度達(dá)80%以上的細(xì)菌種屬信息，采用QIIME軟件分析測(cè)序結(jié)果[5]。通過(guò)Chao1算法計(jì)算各組小鼠腸道菌群辛普森(Simpson)、香農(nóng)(Shannon)指數(shù)，分析腸道菌群多樣性。Shannon指數(shù)越大,生物多樣性越高。Shannon指數(shù)描述種的個(gè)體出現(xiàn)紊亂和不確定性，不確定性越高說(shuō)明生物多樣性越高。綱、種屬水平分析各組小鼠腸道菌群的相對(duì)豐度。

2 結(jié)果

灌胃后各組小鼠體質(zhì)量、血糖、尿白蛋白、尿素氮水平比較見表1。

表1 灌胃后各組小鼠體質(zhì)量、血糖、尿白蛋白、尿素氮水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

各組小鼠腸道菌群OTU指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)比較見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群OTU指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

綱水平上各組小鼠腸道菌群的相對(duì)豐度比較見表3。

表3 綱水平上各組小鼠腸道菌群相對(duì)豐度比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

種屬水平上各組小鼠腸道菌群相對(duì)豐度比較見表4。

3 討論

正常成人腸道內(nèi)細(xì)菌總重量可達(dá)1～1.5 kg，其中益生菌為人體產(chǎn)生多種有益物質(zhì)，幫助機(jī)體維持代謝平衡，從而保護(hù)人類健康[6]。腸道菌群定植于腸道中，通過(guò)其代謝產(chǎn)物，菌體蛋白及其活力影響著人體的代謝、免疫等多個(gè)方面，與疾病的發(fā)生息息相關(guān)[7]。很多因素例如抗生素、應(yīng)激、輻射、腸蠕動(dòng)改變及飲食變化等都可引起腸道菌群結(jié)構(gòu)改變、細(xì)菌代謝活性變化或菌群在局部分布變化而引起的失衡狀態(tài)[6]。在疾病的狀態(tài)下，腸道菌群的多樣性會(huì)發(fā)生改變。研究[8]表明，結(jié)直腸癌患者腸道菌群的多樣性相對(duì)較低。腸道菌群失調(diào)在結(jié)直腸癌及結(jié)直腸腺瘤性息肉患者中表現(xiàn)出顯著性差異[9]。厚壁菌門/擬桿菌門的比值增加與肥胖及糖尿病腎病的發(fā)生密切相關(guān)。糖尿病腎病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)中，雙歧桿菌相對(duì)豐度降低，糞腸球菌相對(duì)豐度增加[10]。有研究[11]認(rèn)為，新診斷T2DM患者腸道菌群結(jié)構(gòu)中，梭狀芽胞桿菌的豐度增加，并降低了擬桿菌的相對(duì)豐度。此外，通過(guò)檢測(cè)T2DM患者血液中細(xì)菌16S rDNA水平，發(fā)現(xiàn)16S rDNA顯著升高，該研究表明腸道菌群通過(guò)改變腸道通透性，參與了T2DM的發(fā)生、發(fā)展[12]。在腎病晚期患者中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌等有益菌數(shù)量減少、糞腸球菌等致病菌數(shù)量增加、炎癥因子也增加，表明T2DM患者處于腎病晚期時(shí)腸道菌群比例失調(diào)，有益菌的減少和致病菌的增加導(dǎo)致體內(nèi)炎癥狀態(tài)惡化，推動(dòng)了2型糖尿病腎病的發(fā)展[13]。在本研究中，與對(duì)照組比較，B組小鼠腸道擬桿菌、疣微菌門豐度顯著下降，硬壁菌門、無(wú)壁[細(xì)]菌類、脫鐵桿菌門豐度上升；擬桿菌與硬壁菌門豐度降低。這些結(jié)果均表明，DN小鼠腸道細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)受到了嚴(yán)重影響。

表4 種屬水平上各組小鼠腸道菌群相對(duì)豐度比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

藥物及飲食干預(yù)可改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，并達(dá)到治療的效果。研究[14]表明，高脂飲食可顯著降低小鼠腸道菌群的多樣性，進(jìn)食高纖維類食物可以增加腸道菌群的多樣性。二甲雙胍處理高脂飲食小鼠，可有效增加腸道中黏蛋白降解細(xì)菌AKKermansia Muciniphila菌相對(duì)豐度，改善糖耐受[17]。本研究中，A組小鼠尿白蛋白、尿素氮水平降低，推測(cè)纈沙坦具有保護(hù)糖尿病腎病小鼠腎臟的作用。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，與B組比較，A組OTU總數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)降低，Shannon指數(shù)升高，說(shuō)明纈沙坦可顯著影響糖尿病腎病小鼠腸道菌群多樣性。與B組比較，綱水平上A組小鼠腸道菌群擬桿菌、疣微菌門豐度上升，壁菌門、無(wú)壁[細(xì)]菌類、脫鐵桿菌門豐度下降。種屬水平上A組小鼠腸道菌群大腸桿菌志賀菌、阿克曼菌豐度上升，Mucispirillum菌豐度下降。這些結(jié)果均表明，纈沙坦可能通過(guò)影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增加db/db小鼠的腸道菌群的多樣性,達(dá)到保護(hù)糖尿病腎病小鼠腎臟的作用。

綜上所述，纈沙坦灌胃的DN小鼠尿白蛋白、尿素氮均降低，纈沙坦灌胃的DN小鼠腸道菌群擬桿菌、疣微菌門、腸桿菌志賀菌和阿克曼菌豐度增加，硬壁菌門、無(wú)壁[細(xì)]菌類、脫鐵桿菌門、Mucispirillum菌豐度降低。纈沙坦可能通過(guò)增加DN小鼠腸道菌群多樣性、影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)，對(duì)DN小鼠腎臟起保護(hù)作用。