黃粉蟲(chóng)主要活性物質(zhì)的提取研究進(jìn)展

李寧，冉學(xué)文，熊曉莉

(重慶工商大學(xué) 重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)運(yùn)工程技術(shù)研究中心，重慶 400067)

黃粉蟲(chóng)是一種人工養(yǎng)殖的資源昆蟲(chóng)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，體內(nèi)含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅可作為飼料，還可用于制作高質(zhì)量的蛋白食品[1]。以黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)(干基)為例：含蛋白質(zhì)多達(dá)48%～55%，脂肪27%～30%、碳水化合物10%～12%，尚含有維生素、激素、酶及無(wú)機(jī)鹽磷、鐵、鉀、鈉、鈣、鐵、鋅、硒、鎂、銅、錳等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高[2-3]。除此之外，黃粉蟲(chóng)還含有對(duì)人體有特殊作用的幾丁質(zhì)[4]、抗菌肽[5]、凝集素[6]等多種功能活性物質(zhì)，可改善人的記憶能力、抗疲勞、抗組織缺氧、延緩衰老、降血壓、緩解貧血等功能[2，6-7]，在食品、醫(yī)療保健、特種養(yǎng)殖、生物柴油等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景[8-12]。目前，關(guān)于黃粉蟲(chóng)體內(nèi)活性物質(zhì)的提取、分離、純化及應(yīng)用的研究并不多。本文綜述了黃粉蟲(chóng)體內(nèi)的降血壓肽、抗菌肽、抗氧化肽、黃酮等具有生物活性物質(zhì)的提取、分離及純化工藝，以及這些活性物質(zhì)在食品保健領(lǐng)域的應(yīng)用前景，為黃粉蟲(chóng)的規(guī)模化、資源化利用提供參考。

1 活性物質(zhì)提取

1.1 多肽

1.1.1 降血壓肽 高血壓為常見(jiàn)的心血管疾病，并會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前，臨床常用的抗高血壓藥主要有利尿劑、β-受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑、血管緊張素Ⅱ-受體拮抗劑等[13]。以上藥物降壓效果明顯，但同時(shí)具有過(guò)度降壓、皮膚過(guò)敏、疲乏等副作用，而從天然產(chǎn)物中獲得的降血壓肽因其降血壓效果明顯，毒副作用低、安全、有效，已成為目前研究的熱點(diǎn)[14]。降血壓肽是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，通過(guò)抑制ACE的活性實(shí)現(xiàn)降低血壓的目的。研究證實(shí)，末端為疏水性氨基酸，更有利于與ACE結(jié)合[15]。因黃粉蟲(chóng)體內(nèi)含有較多的疏水性氨基酸，故黃粉蟲(chóng)可作為提取ACE抑制劑的原料[16-17]。

目前，從黃粉蟲(chóng)體內(nèi)獲得降血壓肽，主要是通過(guò)酶法，該法具有以下優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，選擇性強(qiáng)、無(wú)需高溫高壓設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。酶解過(guò)程大致如下：篩選酶、酶水解、酶滅活、粗分離、濃縮、純化、干燥。常用到的酶有Alcalase堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和膠原蛋白酶等中的一種或幾種。

以黃粉蟲(chóng)蛋白粉為原料，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解，經(jīng)單因素和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后，得出最優(yōu)的工藝條件：70 g/L底物濃度，1%加酶量，于pH 6.5、55 ℃下反應(yīng)7 h。所得產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)58.86%[15]。

以脫脂黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)蛋白粉為原料，在以下條件下酶解，可獲得對(duì)ACE抑制作用較強(qiáng)的酶解產(chǎn)物：Alcalase酶，3%蛋白粉，加酶量4 000 U/g蛋白粉，pH 8.5、50 ℃反應(yīng)，20%水解度，此時(shí)獲得的酶解液，其對(duì)ACE的IC50值為0.39 g/L[18]。研究進(jìn)一步證實(shí)，水解過(guò)程中施加超聲波處理可以加快水解速率。短時(shí)間超聲波處理(5 min內(nèi))可使Alcalase活性增強(qiáng)，但長(zhǎng)時(shí)間超聲波處理會(huì)降低其活性。黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)在酶解過(guò)程中會(huì)伴隨大量色素物質(zhì)生成，導(dǎo)致酶解液為棕黃色，需進(jìn)行脫色處理。實(shí)驗(yàn)表明，3%粉末活性炭用量在pH 3、40 ℃下吸附50 min，黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)降血壓肽酶解液脫色率達(dá)85.3%，脫色后的水解液對(duì)ACE的抑制率達(dá)70.8%[19]。

1.1.2 抗菌肽 抗菌肽是一類小分子多肽類物質(zhì)，廣泛存在于自然界的生物體中，具有分子量小、熱穩(wěn)定、廣譜抗菌、水溶性好等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、水產(chǎn)與畜禽養(yǎng)殖、種植、食品等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景，近年來(lái)是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[20]。

黃粉蟲(chóng)受刺激或被感染后引起免疫應(yīng)答反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抗菌肽，其數(shù)量和抗菌效果受誘導(dǎo)方法、蟲(chóng)態(tài)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)次數(shù)、外源刺激物種類、外源刺激物的強(qiáng)度(濃度)等因素的影響。黃粉蟲(chóng)抗菌肽種類多，不同的誘導(dǎo)和分離方法可獲得不同的抗菌肽。因此，從蟲(chóng)體中提取、分離、純化仍然是抗菌肽研究的基礎(chǔ)和重要組成部分。

索相敏等[21]采用毛細(xì)管提取法提取黃粉蟲(chóng)抗菌肽：將消毒后的黃粉蟲(chóng)，剪去其一對(duì)足，用毛細(xì)管收集其血淋巴。將血淋巴于低溫離心后，將上清液透析，再次離心，獲得抗菌肽含量較高的上清液。該法取出時(shí)未加其他溶劑，減少污染和分離難度，但黃粉蟲(chóng)個(gè)體較小，要得到大量的抗菌肽很困難。故一般采用全蟲(chóng)液氮速凍、高速勻漿后加入合適的緩沖液提取。

以0.1%三氟乙酸作為提取液，經(jīng)粗提、Sephadex-G50預(yù)純化、Sephadex Peptide凝膠柱再純化、Resource 15RPC反相柱純化后，產(chǎn)物抗菌活性較粗提物明顯增強(qiáng)，可能是勻漿法中，抗菌肽所占的比例太小，使其不能發(fā)揮作用[22]。從以上分析也可以看出，抗菌肽的成分復(fù)雜，用勻漿法提取分離的步驟冗長(zhǎng)，收率不高。

王小平等[23]將誘導(dǎo)分離后的抗菌肽，用于測(cè)試對(duì)9種動(dòng)物病原細(xì)菌和10種植物病原細(xì)菌的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃粉蟲(chóng)抗菌肽對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of Tenebrio molitor antibacterial peptide on pathogenic bacteria

由表1可知，黃粉蟲(chóng)抗菌肽雖然具有廣譜抗菌性，但不是對(duì)每種菌都有效。當(dāng)然，這也可能與誘導(dǎo)條件、提取分離條件、抑菌測(cè)試條件、抑菌濃度等因素有關(guān)，如王立新等制備的黃粉蟲(chóng)抗菌肽，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于對(duì)大腸桿菌的抑制效果[24]。程璟俠[25]用超聲誘導(dǎo)黃粉蟲(chóng)后，提取分離了其體內(nèi)的抗菌肽，并從這些抗菌物質(zhì)中，分離出活性最強(qiáng)的一種抗菌肽作為K562癌細(xì)胞的抑制劑，以羥基脲為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗菌肽對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制效果明顯高于對(duì)照組。抗菌肽使大量的細(xì)胞阻滯在G1期(DNA合成前期)，抑制了S期DNA合成，說(shuō)明抗菌肽可通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮抗K562細(xì)胞的作用。

目前，天然抗菌肽仍存在以下問(wèn)題：①抗菌活力和抗菌譜和傳統(tǒng)抗生素相比仍顯不足；②用法用量不清：其毒理性和藥理藥效方面的研究還需深入；③尚不能規(guī)模化生產(chǎn)：因生物體中天然抗菌肽含量很低，提取工藝繁瑣，得率不高；抗菌肽的天然結(jié)構(gòu)及活性難以維持，這些大大限制了其大規(guī)模應(yīng)用。當(dāng)然，抗菌肽有自身的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)，隨著研究不斷深入，仍有望成為一種新型生物制劑[26]。

1.1.4 抗凍多肽 抗凍多肽(蛋白)可以非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)，而不影響溶液的熔點(diǎn)，在食品、藥品冰凍、貯藏、運(yùn)輸和解凍過(guò)程中能抑制重結(jié)晶，并能減少滴液。Ramsay等[30-31]率先在黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有凝固點(diǎn)抑制活性的蛋白(FPDP)。后來(lái)的研究人員從黃粉蟲(chóng)體內(nèi)分離得到了較純的FPDP，大致分離過(guò)程如下：將處于-1 ℃下黑暗環(huán)境中2周的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)，在50%乙醇2次勻漿，離心取上清液。用不同的Sephadex離子交換樹(shù)脂吸附蛋白質(zhì)，然后以NaCl溶液洗提，洗提液通過(guò)超濾膜濃縮，濃縮液再通過(guò)SephadexG50凝膠過(guò)濾、離子交換色譜脫鹽、等電聚焦等作用后，得到純度較高的FPDP[32]?，F(xiàn)有研究表明，在相同濃度下，黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白的熱滯活性是一般魚(yú)類抗凍蛋白的10倍～100倍。Graham等[32]從黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)中分離的抗凍蛋白在1 mg/L的濃度下可以達(dá)到5.5 ℃的熱滯活性，其抗凍活性是魚(yú)類的數(shù)倍甚至上百倍，富含半胱氨酸、蘇氨酸，相對(duì)分子量8 400。目前抗凍蛋白市場(chǎng)售價(jià)很高，限制了抗凍蛋白在商品中的應(yīng)用。

1.2 黃酮

汪璇[33]以脫脂黃粉蟲(chóng)粉為原料，在超聲波輔助下提取黃粉蟲(chóng)黃酮，優(yōu)化的提取條件為：蟲(chóng)粉∶水=1∶18 g/mL，適當(dāng)?shù)某曁崛l件(30 min、58 ℃、功率380 W)，得到粗黃酮(CF)提取量為11.47 mg/g黃粉蟲(chóng)。然后用XDA-1型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)粗黃酮進(jìn)行精制，獲得最佳分離條件：上樣液1.0 g/L，pH 5，2 BV/h 吸附流速、2 BV樣量；洗脫2 BV/h、60%乙醇、3 BV洗脫液體積，經(jīng)純化后，黃酮純度由3.74%提高到16.34%，得到精制黃酮(PF)。

1.3 酶

1.3.1 纖維素酶 纖維素酶可對(duì)纖維素分子進(jìn)行降解，是一類具有特定催化功能的活性蛋白質(zhì)。冰浴條件下解剖出黃粉蟲(chóng)的腸道，按蟲(chóng)重和溶液體積比1∶1加入0.2 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，冰浴勻漿后，迅速在4 ℃、15 000 r/min條件下離心10 min，取上清液為纖維素酶的粗酶液，經(jīng)檢測(cè)，在黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了2種纖維素消化酶：內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)[34]。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿酯酶(AChE)可使神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在完成神經(jīng)興奮的傳遞后盡快降解，以維持生物體內(nèi)的神經(jīng)沖動(dòng)正常傳遞，是神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶。取黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)胸部(頭部)，按1∶10 g/mL比例加入磷酸鈉鹽緩沖液，勻漿。4 ℃下，將勻漿液離心30 min，得粗酶液。將粗酶液過(guò)層析柱精制(SephadexG-200、洗脫液為磷酸鈉鹽緩沖液，洗脫12 h)，得到純化倍數(shù)18.84的AChE。研究還表明，黃粉蟲(chóng)體內(nèi)占總活性75%左右的AChE主要集中在其胸部和頭部，幼蟲(chóng)相應(yīng)部位的活性明顯低于成蟲(chóng)[36]。

1.3.4 超氧化歧化酶 超氧化歧化酶(SOD)是一類源于生命體的活性物質(zhì)，能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，消除新陳代謝中產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，具有抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、抑制心腦血管疾病、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功能，在醫(yī)藥、日用化工、保健食品等領(lǐng)域是一種重要的添加劑。原料不同，SOD的制備方法不同。目前，提取SOD的主要原料為動(dòng)物血、植物組織、微生物。吳蕾等[37]報(bào)道了黃粉蟲(chóng)中SOD的提取、純化方法。取黃粉蟲(chóng)干粉，與磷酸鈉緩沖液一起研磨，冷凍離心，收集上清液，用(NH4)2SO4沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液。再次將沉淀溶解于上述磷酸鹽緩沖液，靜置離心，棄去沉淀，透析、脫鹽、濃縮得到純化的SOD，經(jīng)鑒定為Cu-Zn-SOD。

1.4 抗凝集素

血栓性疾病是近年來(lái)威脅人類健康的最嚴(yán)重疾病之一，目前臨床多以抗凝、溶栓藥及抗血小板等藥物防治。由于傳統(tǒng)藥物的局限性，凝血因子X(jué)a抑制劑成為了研究的熱點(diǎn)[38]。Lee等[6]將凍干的黃粉蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，用含有1%醋酸的乙醇溶液回流，然后將粗提物懸浮在水中，然后依次用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯提取，將乙酸乙酯提取物部分用色譜進(jìn)行分離，可得到具有抗血栓和抗血小板凝集作用的化合物L(fēng)-脯氨酰-L-酪氨酰和N-乙酰酪胺，這些化合物有望成為一種預(yù)防或治療血管性疾病的藥物。

1.5 殼多糖

殼多糖在醫(yī)療保健、食品添加劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、環(huán)境保護(hù)等方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值[39-40]。從黃粉蟲(chóng)提取殼多糖，具有原料來(lái)源穩(wěn)定、含量豐富、產(chǎn)品灰分含量低、提取條件相對(duì)溫和等優(yōu)勢(shì)，提取的方法主要有酸堿法、酶法、微生物法[39-42]。課題組將黃粉蟲(chóng)殼聚糖，加入少量稀酸和過(guò)氧化氫混合液，置于50 ℃恒溫處理5 h，經(jīng)中和、醇沉、離心后，收集沉淀，干燥，即可得到水溶性的殼多糖。研究證實(shí)，制得的水溶性殼多糖，對(duì)大腸桿菌具有很好的抑制作用，具有成膜作用，可用于果蔬保鮮、醫(yī)療保健、消毒等方面。將水溶性殼多糖用于鮮切蘋(píng)果的保鮮實(shí)驗(yàn)中，可使蘋(píng)果的褐變、重量損失率和硬度相對(duì)于對(duì)照組分別降低66.8%，19.7%和39.3%，有機(jī)酸損失不明顯，保鮮效果優(yōu)于殼聚糖和其他保鮮劑[43-45]。

2 展望

黃粉蟲(chóng)作為一種潛在的資源，因具有容易獲得、蛋白質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)合理、加工特性良、活性物質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)而引起了廣泛的關(guān)注。黃粉蟲(chóng)集多種功效于一體的活性物質(zhì)于一身，這在天然食物、藥物資源類物質(zhì)中并不多見(jiàn)。黃粉蟲(chóng)養(yǎng)殖雖然有多年的歷史，但對(duì)黃粉蟲(chóng)的研究還僅停留于較初級(jí)階段，對(duì)其體內(nèi)活性物質(zhì)種類、提取工藝、成本控制、應(yīng)用領(lǐng)域等問(wèn)題，尚有很多亟待解決的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃粉蟲(chóng)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用，仍有較大的研究空間。