申?duì)顮?李昱櫻 榮二花 吳玉香

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陸地棉和野生斯特提棉種間異源六倍體的合成與性狀鑒定

申?duì)顮?李昱櫻 榮二花 吳玉香*

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西太谷 030801

陸地棉()是世界上重要的栽培棉種, 野生斯特提棉()含有陸地棉所缺乏的許多優(yōu)質(zhì)基因。本研究通過(guò)陸地棉和斯特提棉的遠(yuǎn)緣雜交和染色體加倍, 獲得了自交可育的后代植株, 對(duì)其進(jìn)行流式細(xì)胞倍性檢測(cè)和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察, 篩選出2株染色體組完整的異源六倍體植株。統(tǒng)計(jì)鑒定表明, 六倍體和親本及三倍體比較, 葉形介于雙親之間, 葉面積增大, 保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)明顯增多; 遠(yuǎn)緣雜種與親本在花的表型性狀方面差異明顯, 六倍體的花粉粒直徑大于親本和三倍體; 六倍體棉纖維為白色, 長(zhǎng)度小于母本陸地棉, 父本斯特提棉的種子腺體延緩發(fā)育性狀在異源六倍體中得到表達(dá)。這些結(jié)果證明通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和加倍成功獲得了陸地棉與斯特提棉間可育的異源六倍體新種質(zhì), 為棉花遺傳育種研究提供了有價(jià)值的材料。

斯特提棉; 遠(yuǎn)緣雜交; 異源六倍體; 種子腺體延緩發(fā)育

遠(yuǎn)緣雜交伴隨著多倍化是新物種形成的重要途徑[1-2]。棉花的遠(yuǎn)緣雜交有利于促進(jìn)種屬間的基因交流, 比種內(nèi)雜交更容易獲得新的種質(zhì)資源。種質(zhì)資源是棉花育種的重要基礎(chǔ), 長(zhǎng)期以來(lái), 棉花育種家做了大量的遠(yuǎn)緣雜交研究, 希望創(chuàng)造出近緣雜交所無(wú)法得到的優(yōu)異特性。陸地棉()是世界上重要的栽培棉種, 然而現(xiàn)有的栽培品種由于親緣關(guān)系太近, 難以拓寬陸地棉的遺傳基礎(chǔ)[3]。野生棉含有栽培棉所缺乏的許多優(yōu)質(zhì)基因, 挖掘野生棉資源是棉花育種的一個(gè)重要方向[4]。野生斯特提棉()具有許多優(yōu)良性狀, 如耐低溫、抗黃萎病、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、纖維優(yōu)質(zhì)以及種子腺體延緩發(fā)育等[5-6]。將這些優(yōu)良基因通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)移到陸地棉, 對(duì)棉花育種和生產(chǎn)有重要作用。1935年開(kāi)始, 國(guó)外學(xué)者[5-7]和我國(guó)的姜茹琴等[8]、李育強(qiáng)等[9]、崔榮霞等[10]和梁正蘭等[5]先后報(bào)道了陸地棉和斯特提棉的雜交研究。這些研究證明陸地棉與斯特提棉的三倍體雜種不育, 減數(shù)分裂過(guò)程中單價(jià)體數(shù)量多, 染色體同源性低, 兩親本親緣關(guān)系遠(yuǎn), 通過(guò)染色體加倍和回交技術(shù)恢復(fù)其育性, 獲得了新的種質(zhì)資源和品種, 在棉花育種方面取得顯著成就。但目前尚未獲得陸地棉與斯特提棉種間染色體數(shù)完整、可以穩(wěn)定遺傳的異源六倍體種質(zhì), 該種質(zhì)對(duì)棉花遠(yuǎn)緣雜交、染色體加倍和物種進(jìn)化研究具有重要價(jià)值, 有助于更好地利用棉花野生種質(zhì)資源開(kāi)展育種研究。

本實(shí)驗(yàn)室在2015年亦報(bào)道了利用陸地棉品種中棉所12和斯特提棉進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新探索的研究, 獲得的雜種植株可結(jié)鈴但無(wú)可育種子[6]。本研究重新選擇陸地棉品種中棉所16作母本與野生斯特提棉雜交, 對(duì)雜種幼苗進(jìn)行秋水仙堿染色體加倍, 雜種植株育性恢復(fù), 此世代植株為混倍體, 倍性與性狀不穩(wěn)定。將收獲的種子繼續(xù)種植, 對(duì)可育植株進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)和流式細(xì)胞倍性鑒定, 對(duì)其葉片、花、纖維和種子腺體發(fā)育等性狀進(jìn)行初步評(píng)價(jià), 以期篩選出染色體數(shù)完整可以穩(wěn)定遺傳的異源六倍體新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

母本陸地棉品種中棉所16來(lái)源于中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所, 父本野生斯特提棉來(lái)源于國(guó)家種質(zhì)三亞野生棉圃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

陸地棉(AADD)作母本P1, 野生斯特提棉(CC)作父本P2, 進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交, 獲得三倍體雜種F1(ADC), 對(duì)F1幼苗進(jìn)行多倍體誘變得到M0代(AADDCC)植株, 將M0代植株所得種子播種得到M1代(AADDCC)植株, 對(duì)4個(gè)不同世代P1、P2、F1和M1進(jìn)行比較鑒定。所用材料均以盆栽的方式保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 遠(yuǎn)緣雜交 以陸地棉為母本, 早上6:00左右選擇即將開(kāi)放的花蕾去雄, 套上蠟管待用。上午9:00以后, 取當(dāng)天開(kāi)放的父本斯特提棉的花粉給去雄的陸地棉授粉, 繼續(xù)套上蠟管, 在苞葉內(nèi)滴加25 mg L–1的赤霉素保鈴。

1.3.2 多倍體誘變 將棉種播于營(yíng)養(yǎng)缽, 待幼苗子葉展開(kāi)當(dāng)天, 用0.2%秋水仙堿凝膠包裹幼苗生長(zhǎng)點(diǎn), 蓋上透明罩杯保證濕度, 48 h后去除凝膠并用水沖洗干凈; 待幼苗恢復(fù)生長(zhǎng)后移栽到花盆, 冬天轉(zhuǎn)移到溫室保存。

1.3.3 流式細(xì)胞檢測(cè) 取2 cm × 3 cm大小的幼嫩葉片, 將其切碎, 置400 μL裂解液中以提取完整細(xì)胞核, 用30 μm濾網(wǎng)過(guò)濾裂解液至樣品管中, 加入1600 μL染液, 上機(jī)測(cè)試(CyFlow Space, Sysmex Partec)。

1.3.4 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察 選取3~5 mm大小的花蕾, 浸泡在卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇∶氯仿∶冰乙酸= 5∶3∶2) 24 h, 蒸餾水沖洗浸泡20 min, 濾紙吸干, 取3~5?；ㄋ幱谳d玻片上, 滴加卡寶品紅, 用鑷子將花藥壓破, 去除雜質(zhì), 蓋上蓋玻片, 輕輕壓緊, 顯微鏡下觀察。

1.3.5 氣孔葉綠體計(jì)數(shù) 選取生長(zhǎng)良好的倒四葉或倒五葉沖洗干凈; 切取葉片主脈附近1 cm × 2 cm部分, 浸入卡諾氏固定液脫色處理48 h以上; 將脫色的葉片用蒸餾水沖洗浸泡10 min以上, 切取約2 mm × 2 mm葉片于載玻片上, 下表皮朝上, 用1%的I2-KI溶液染色5~10 min, 蓋上蓋玻片; 在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù), 每株統(tǒng)計(jì)30個(gè)氣孔。

1.3.6 花粉粒直徑測(cè)定 選取當(dāng)天開(kāi)放的花, 取3~5?；ㄋ幹幂d玻片上, 滴加卡寶品紅, 并用鑷子壓碎, 蓋上蓋玻片, 在顯微鏡下測(cè)量花粉粒直徑。取每株棉花2~3朵花, 共測(cè)量150個(gè)花粉粒。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究所得數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

2.1.1 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 從M1中選取6株(M1-1至M1-6)植株鑒定倍性, 以四倍體母本P1和二倍體父本P2做參照, 用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)F1以及M1-1至M1-6的相對(duì)DNA含量。結(jié)果顯示, P2、F1和P1的峰值分別位于98.81、122.89和140.44, 表明F1的DNA含量為P1和P2兩親本之和的一半; M1代中, M1-4和M1-5的峰值位于239.88和239.92, 表明其DNA含量接近P1與P2之和, M1-1、M1-2和M1-3的DNA含量介于三倍體和六倍體之間, M1-6的DNA含量大于六倍體(表1)。這些結(jié)果表明, F1為陸地棉和斯特提棉的真雜種, 所測(cè)M1代中有2株為異源六倍體(M1-4和M1-5), 有4株為非整倍體(M1-1、M1-2、M1-3和M1-6)。

2.1.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察 根據(jù)流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果, 對(duì)2株DNA含量完整的異源六倍體植株進(jìn)行花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察, 并與P1和F1比較。結(jié)果顯示, P1減數(shù)分裂行為正常, 四分體時(shí)期正常四分體比例為100%; F1減數(shù)分裂行為異常, 主要表現(xiàn)在減數(shù)分裂后期I, 染色體向多極不均等分離, 并且分離不同步, 出現(xiàn)大量染色體橋和無(wú)著絲粒的染色體片段, 最終形成的正常四分體比例僅占4.24%; M1代異源六倍體植株的減數(shù)分裂行為已趨于正常, 在終變期可以清晰觀察到39對(duì)二價(jià)體, 在減數(shù)分裂中期II, 可觀察到均等分離的78條染色體, 在四分體時(shí)期, 正常四分體比例達(dá)94.5% (圖1)。這些細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明, 本研究獲得了陸地棉與斯特提棉的異源六倍體新種質(zhì), 并且其減數(shù)分裂行為已趨于正常。

表1 不同世代流式細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果

圖1 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂表現(xiàn)

A: P1中期II; B: P1后期II; C: P1四分體; D: F1后期I; E: F1后期I; F: F1異常四分體; G: M1終變期; H: M1中期II; I: M1四分體。

A: metaphase II of P1; B: anaphase II of P1; C: tetrad of P1; D: anaphase I of F1; E: anaphase I of F1; F: abnormal tetrad of F1; G: diakinesis of M1; H: metaphase II of M1; I: tetrad of M1.

2.2 表型鑒定

2.2.1 葉片性狀統(tǒng)計(jì) 不同世代植株的葉片大小、葉形、葉色以及葉柄顏色等表型差異大(圖2)。對(duì)P1、P2、F1和M1的葉面積、葉形指數(shù)(葉長(zhǎng)/葉寬)和葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目(以下簡(jiǎn)稱(chēng)葉綠體數(shù))統(tǒng)計(jì)顯示, F1與M1在葉面積、葉形指數(shù)和葉綠體數(shù)均存在極顯著差異(表2)。隨著倍性增大, 不同世代葉形指數(shù)均呈下降趨勢(shì), 葉面積和葉綠體數(shù)目呈上升趨勢(shì), 親本因自身基因組差異而不完全符合該變化趨勢(shì)(圖3)。這些結(jié)果證明六倍體葉形介于雙親之間, 葉面積增大, 保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)明顯增多, 這對(duì)遠(yuǎn)緣雜種的光合作用等生理功能具有重要意義。

圖2 不同世代葉片形態(tài)比較

表2 不同世代間葉片性狀的差異顯著性分析

大小寫(xiě)字母分別表示在0.01和0.05概率水平上顯著差異。

Values within a column followed by different capital letters and small letter are significantly different at< 0.01 and< 0.05, respectively.

圖3 葉面積、葉形指數(shù)和葉綠體數(shù)在不同倍性間的變化趨勢(shì)

2.2.2 花的表型性狀和花粉粒直徑統(tǒng)計(jì) 遠(yuǎn)緣雜種與親本在花瓣顏色和大小、花斑的有無(wú)、花藥顏色和數(shù)量、柱頭長(zhǎng)短以及苞葉形態(tài)等方面均存在明顯差異; 在F1和M1之間, 花的表型性狀整體相近, 但M1的花藥數(shù)量明顯少于F1(圖4)?；ǚ哿Ｖ睆筋l率直方圖顯示, P1花粉粒直徑集中在100~120 μm之間; P2花粉粒直徑集中在90~110 μm之間; F1花粉粒直徑明顯小于雙親, 且變異范圍大, 集中在20~100 μm之間; M1花粉粒直徑最大, 集中在100~140 μm之間(圖5)。

2.2.3 棉纖維和種子腺體觀察 陸地棉與斯特提棉種間異源六倍體棉纖維為白色, 纖維長(zhǎng)度明顯小于陸地棉。異源六倍體表現(xiàn)出與斯特提棉相似的種子腺體延緩發(fā)育性狀, P1和F1種子表面有腺體, P2和M1種子表面無(wú)肉眼可見(jiàn)腺體, 進(jìn)一步在體視顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), F1種子腺體密度明顯小于P1, P2種子表面無(wú)腺體, M1種子表面有極少數(shù)顏色較淡的腺體, 種子表面腺體密度總體趨勢(shì)為P2

圖4 不同世代花的表型性狀比較(標(biāo)尺: 20 mm)

3 討論

3.1 陸地棉與斯特提棉的遠(yuǎn)緣雜交探討

陸地棉農(nóng)藝性狀優(yōu)良, 栽培范圍廣, 長(zhǎng)期以來(lái), 棉屬遠(yuǎn)緣雜交研究多以陸地棉做母本, 希望將棉屬其他種的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移到陸地棉中。斯特提棉具有耐低溫、抗黃萎病、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、纖維優(yōu)質(zhì)以及種子腺體延緩發(fā)育等多種優(yōu)良性狀[5-6], 是棉花遠(yuǎn)緣雜交育種關(guān)注度較高的一個(gè)野生種。我國(guó)關(guān)于陸地棉和斯特提棉的遠(yuǎn)緣雜交研究起步較晚, 但也獲得了顯著成效。姜茹琴等[8]用陸地棉與斯特提棉雜交, 對(duì)雜種進(jìn)行胚胎培養(yǎng)和試管內(nèi)染色體加倍, 獲得的雜種后代多為混倍體, 根尖染色體數(shù)39~50條不等, 用可育株與陸地棉回交, 選育出一批棉花新品種。李育強(qiáng)等[9]以陸地棉和海島棉為母本分別與斯特提棉雜交獲得F1代, 觀察其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為, 認(rèn)為棉屬A、C和D三個(gè)染色體組間同源性極低。崔榮霞等[10]在獲得陸地棉與斯特提棉雜種F1代后, 對(duì)其枝條進(jìn)行誘變加倍和扦插繁殖, 但無(wú)法獲得可育植株, 繼續(xù)與陸地棉回交獲得BC1, 亦沒(méi)有可育植株, 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂結(jié)果顯示F1和BC1為非整倍體。梁正蘭等[5]通過(guò)陸地棉和斯特提棉雜交, 胚的離體培養(yǎng), 誘變加倍和回交等技術(shù)方法獲得了新的種質(zhì)資源和品種, 但并未獲得真正的異源六倍體植株。本研究用陸地棉與斯特提棉進(jìn)行雜交和染色體加倍, 通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察, 篩選出2株染色體數(shù)完整的異源六倍體植株, 對(duì)斯特提棉在棉花育種中的開(kāi)發(fā)利用和棉屬遠(yuǎn)緣雜交育種研究具有重要價(jià)值。

圖5 不同世代花粉粒直徑的頻率直方圖

圖6 不同世代種子腺體性狀比較

3.2 棉花種子腺體延緩發(fā)育性狀探討

種子無(wú)腺體而植株有腺體, 是棉花育種家想要轉(zhuǎn)移到陸地棉中的一個(gè)重要性狀, 但至今沒(méi)有獲得可用于生產(chǎn)的棉花品種。目前已發(fā)現(xiàn)的具有種子腺體延緩發(fā)育性狀的棉種為分布在澳洲的幾個(gè)野生二倍體棉種, 如斯特提棉、比克氏棉、澳洲棉、納爾遜氏棉、南岱華棉等。李炳林等[11]報(bào)道了其獲得的亞洲棉和比克氏棉的異源四倍體帶有種子腺體延緩發(fā)育性狀, 并且可以穩(wěn)定遺傳。張?zhí)煺娴萚12]對(duì)具有種子低棉酚、植株有腺體(但低于常規(guī)品種)的陸地棉突變體分析發(fā)現(xiàn), 其突變基因是Gl的復(fù)等位基因。Zhu等[13]用亞洲棉與比克氏棉的異源四倍體與陸地棉雜交后不斷回交和自交, 獲得了帶有種子腺體延緩發(fā)育性狀的陸地棉種質(zhì), 遺傳分析表明來(lái)自比克氏棉的腺體發(fā)育基因位于Gl基因位點(diǎn)。

圖7 不同世代子葉腺體性狀比較

關(guān)于棉屬不同種所攜帶的腺體發(fā)育基因之間的互作關(guān)系, 祝水金等[14-15]用5個(gè)帶有種子腺體延緩發(fā)育性狀的澳洲野生棉種與A染色體組亞洲棉、D染色體組戴維遜氏棉以及AD染色體組的陸地棉4種不同色素腺體基因型(GlGlGlGl、GlGlglgl、glglGlGl和glglglgl)雜交, 初步明確5個(gè)澳洲棉野生種的腺體性狀表達(dá)有個(gè)別差異, 但控制該性狀的基因位于同一基因位點(diǎn); 該基因?qū)染色體組亞洲棉為顯性, 對(duì)D染色體組戴維遜氏棉為隱性, 對(duì)陸地棉Gl為顯性上位, 對(duì)陸地棉Gl為隱性上位。另外, Liu等[16]在對(duì)草棉和澳洲棉雜交加倍后發(fā)現(xiàn), 其獲得的異源四倍體與母本草棉相比, 種子腺體數(shù)大大減少, 但仍有少量腺體, 這表明控制目標(biāo)性狀的非等位基因間并不是單純的顯隱性互作關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)尚有矛盾之處, 需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明控制棉花腺體發(fā)育基因之間的互作關(guān)系。本研究獲得了陸地棉與斯特提棉的種間異源六倍體新種質(zhì), 帶有與斯特提棉相似的種子腺體延緩發(fā)育性狀, 種子腺體密度表現(xiàn)出P2

3.3 異源六倍體種質(zhì)創(chuàng)新及利用價(jià)值

本研究獲得異源六倍體可育后代, 其減數(shù)分裂行為已經(jīng)趨于正常, 但不同六倍體植株間育性差異明顯, 這為研究基因互作、表達(dá)調(diào)控及植株生理狀況等因素對(duì)遠(yuǎn)緣雜種育性的影響提供了有價(jià)值的材料。異源六倍體具有種子腺體延緩發(fā)育特性, 種子腺體密度表現(xiàn)為P2

在異源六倍體后代群體中, 易出現(xiàn)非整倍體植株, 需采取措施使其倍性穩(wěn)定遺傳。李炳林等[11]合成的亞洲棉與比克氏棉的異源四倍體, 初代胚根異常, 無(wú)法栽培成活, 通過(guò)嫁接和誘導(dǎo)生根進(jìn)行多代繁殖, 獲得了可正常生長(zhǎng)且育性恢復(fù)良好的異源四倍體。吳玉香等[17]對(duì)亞洲棉、草棉、陸地棉和海島棉四元雜種的減數(shù)分裂染色體構(gòu)型和花粉?；钚远嗄隃y(cè)定證明, 活體保存對(duì)染色體組之間的協(xié)調(diào)和遠(yuǎn)緣雜種育性恢復(fù)有重要作用。本研究可以通過(guò)活體保存和多代繁殖的方法進(jìn)一步穩(wěn)定異源六倍體的倍性和育性。

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Allohexaploid synthesis and its characteristic identification between cotton speciesand

SHEN Zhuang-Zhuang, LI Yu-Ying, RONG Er-Hua, and WU Yu-Xiang*

College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China

is an important cultivated cotton species andis a wild cotton species with many excellent characteristics. In this study, we obtained fertile offsprings by interspecific distant hybridization and chromosome doubling betweenandThrough flow cytometry and meiosis observation of pollen mother cells, two heterohexaploid plants with complete chromosomes were selected. Further, the characteristic identification of their leaves, flowers and seeds was carried out, showing that the leaf shape of hexaploid was between their parents with increased leaf area, and the number of chloroplasts in guard cells obviously more than that of their parents and triploid. The flowers were significantly different between distant hybrids and their parents, and the pollen grain diameter of hexaploid was larger than that of parents and triploid. The fiber color of hexaploid was white, and the fiber length was shorter than that of, and the traits of delayed seed gland development coming fromwere expressed in the allohexaploid hybrids. These results of synthesized new fertile allohexaploid germplasms betweenandprovide new valuable materials for the study of cotton genetics and breeding.

; distant hybrid; allohexaploid; delayed seed gland development

): 2018-06-22;

2019-01-12;

2019-02-03.

10.3724/SP.J.1006.2019.84086

吳玉香, E-mail: yuxiangwu2009@hotmail.com

E-mail: shenzz956@163.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171599), 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家基金培育匹配項(xiàng)目(2017GPY04)和山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(201803D221018-7)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31171599), the National Foundation Fostering Matching Project of Shanxi Agricultural University (2017GPY04), and the Key Research and Development Program Projects in Shanxi Province (201803D221018-7).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190202.1254.002.html