朱竟赫 劉 馳 劉 禾 武曉琳 喬菊久 李 淼 范英蘭 包玉龍 齊 越 胡麗萍

(1. 遼寧省中醫(yī)藥研究院,沈陽(yáng) 110034)(2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110847)

大、小鼠皮下大劑量注射異丙腎上腺素(ISO)能導(dǎo)致心肌缺血，與人的心肌缺血癥狀較為接近，是常用的、經(jīng)典的抗心肌缺血作用評(píng)價(jià)模型，例如譚文明等[1]和焦淑萍等[2]分別利用ISO對(duì)大鼠和小鼠進(jìn)行了心肌缺血模型的制備。但采用此法建立慢性心肌缺血模型的造模方法、造模劑量及評(píng)價(jià)指標(biāo)尚缺少系統(tǒng)的試驗(yàn)研究，文獻(xiàn)報(bào)道的方法繁多但無(wú)統(tǒng)一的、客觀的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。

ISO為β受體激動(dòng)劑，可使心肌劇烈收縮而缺血缺氧,產(chǎn)生大量的ONOO-和氧自由基,對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷[3]。Prabhu等[4]發(fā)現(xiàn)大劑量ISO可導(dǎo)致心肌線粒體組織蛋白酶-D和β葡萄糖醛酸酶活性顯著降低,心肌線粒體膜穩(wěn)定性下降。當(dāng)心臟負(fù)擔(dān)過(guò)重時(shí)也可導(dǎo)致心肌微循環(huán)障礙，引發(fā)缺血性病變[5]。大劑量注射ISO使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)被高度激活，可導(dǎo)致心功能進(jìn)行性惡化并形成惡性循環(huán)[6]。因此，ISO成為使用頻率較高的經(jīng)典的心肌缺血模型造模藥物之一。

本文采用不同劑量ISO對(duì)小鼠進(jìn)行頸部皮下注射，建立小鼠慢性心肌缺血模型，觀測(cè)各模型組兩周內(nèi)的心電圖、生化指標(biāo)及病理指標(biāo)的改變。通過(guò)比較確定最佳造模劑量，建立較為客觀、可靠的慢性心肌缺血模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為相關(guān)模型制備及藥效評(píng)價(jià)研究提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑；ISO：上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：101101，規(guī)格：2 mL:1mg；水合氯醛：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：20081120。

1.1.2儀器：ML785多導(dǎo)生理記錄儀：澳大利亞AD；AU5800型全自動(dòng)生化分析儀：美國(guó)BECKMAN COULTER。

1.1.3動(dòng)物：SPF級(jí)雄性KM小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001

1.1.4飼養(yǎng)環(huán)境：小鼠飼養(yǎng)于遼寧省中醫(yī)藥研究院(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2012-0003]，屏障環(huán)境，溫度：21～25 ℃,濕度45%～60%；動(dòng)物自由采食和飲水，墊料每3日更換一次。顆粒飼料及玉米芯墊料，均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010]。

1.2 方法

SPF級(jí)雄性KM小鼠160只，隨機(jī)分為4組，每組40只，分別為空白組(生理鹽水)、高劑量組(ISO，32 mg/kg體質(zhì)量)、模型中劑量組(ISO，16 mg/kg體質(zhì)量)、模型低劑量組(ISO，8 mg/kg體質(zhì)量)。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，腹腔注射4%水合氯醛，按每千克體質(zhì)量0.4 g麻醉，Ⅱ?qū)?lián)描記各組小鼠造模前心電圖。恢復(fù)性飼養(yǎng)3 d。各組按每千克體質(zhì)量10 mL給藥，頸部皮下注射相應(yīng)濃度的ISO(0.32%、0.16%和0.08%)，每日8:30定時(shí)注射，每日一次，連續(xù)造模3 d。末次注射ISO當(dāng)晚禁食不禁水16 h，第二天麻醉前統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率，末次注射ISO后24 h，每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，Ⅱ?qū)?lián)描記造模24 h后心電圖?；謴?fù)性飼養(yǎng)待到末次注射ISO后第8天，每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，Ⅱ?qū)?lián)描記造模后8 d心電圖，每組取10只小鼠眼眶采血1 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取血清，AU5800型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌鈣蛋白T(CTN-T)。引頸法處死后，摘取心臟甲醛固定, HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察各組心肌形態(tài)學(xué)改變并拍照。其余小鼠恢復(fù)性飼養(yǎng)待到末次注射ISO后第15天，每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，Ⅱ?qū)?lián)描記造模后15 d心電圖，每只小鼠眼眶采血檢測(cè)生化指標(biāo)；引頸法處死后，心臟HE染色并觀察病變情況。

記錄每只小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的心電圖，采用LabChart8讀取T波高度，每只小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)4個(gè)波為1段取一個(gè)平均T波高度值，取3段的平均值作為該鼠該時(shí)間點(diǎn)的T波高度數(shù)值。

采用造模后24 h、8d及15 d心電圖的T波高度分別與該鼠造模前心電圖的T波高度做差并取其絕對(duì)值，得出造模后各時(shí)間點(diǎn)的T波變化量；然后以T波變化量除以該鼠造模前心電圖的T波高度，得出造模后各時(shí)間點(diǎn)的T波變化率[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 心電圖

四組小鼠造模前、造模后24 h、造模后8 d及造模后15 d心電圖見(jiàn)圖1～4。各時(shí)間點(diǎn)T波高度、T波變化量及T波變化率見(jiàn)表1。

由表1可知，造模后各時(shí)間點(diǎn)T波高度均以自身造模前T波高度作為參照得出變化量及變化率，結(jié)果如下：各組造模后24 h、8d及15 d的T波高度較造模前均有所降低；中劑量組造模后24 h的T波高度顯著低于空白組(P<0.05)。高劑量組造模后15 d的T波變化量顯著高于空白組(P<0.01)；中劑量組造模后24 h、8d及15 d的T波變化量顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組造模后15 d的T波變化率顯著高于空白組(P<0.05)；中劑量組造模后24 h、8d的T波變化率顯著高于空白組(P<0.01)；中劑量組造模后15 d的T波變化率顯著高于空白組(P<0.05)。

圖1 空白組心電圖 Fig.1 Electrocardiogram of control group

圖2 高劑量組心電圖Fig.2 Electrocardiogram of high dose group

圖3 中劑量組心電圖Fig.3 Electrocardiogram of middle dose group

圖4 低劑量組心電圖Fig.4 Electrocardiogram of low dose group

項(xiàng)目空白組高劑量組中劑量組低劑量組造模前造模后24 h造模后8 d造模后15 d動(dòng)物數(shù)/n40404040T波高度/mV0.19±0.080.20±0.030.21±0.060.21±0.06動(dòng)物數(shù)/n40233035T波高度/mV0.14±0.060.11±0.100.05±0.13?0.10±0.11T波變化量/mV0.07±0.060.10±0.060.17±0.11??0.13±0.09T波變化率/%36.89±23.0053.67±35.9984.31±54.73??64.94±39.19動(dòng)物數(shù)/n40233035T波高度/mV0.13±0.050.09±0.130.09±0.100.11±0.07T波變化量/mV0.06±0.060.12±0.070.15±0.10??0.11±0.06T波變化率/%34.19±22.6462.53±42.1677.02±51.92??48.69±26.50動(dòng)物數(shù)/n30132025T波高度/mV0.09±0.050.04±0.070.07±0.110.12±0.07T波變化量/mV0.06±0.040.15±0.09??0.15±0.08??0.09±0.07T波變化率/%38.57±28.2282.10±55.46?71.55±37.00?40.20±23.89

注：與空白組相比*P<0.05,**P<0.01

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 心肌損傷標(biāo)志物

造模小鼠分別于造模后8 d、15 d進(jìn)行眼眶采血，血清中心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 造模后8 d的AST、CK、CK-MB、LDH及CTN-T數(shù)據(jù)Table 2 The data of AST、CK、CK-MB、LDH and CTN-T after 8 d of animal models

注：與空白組相比*P<0.05,**P<0.01

Note: Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

高劑量組、低劑量組AST顯著高于空白組(P<0.05)；中劑量組AST極顯著高于空白組(P<0.01)。中劑量組CK極顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組、中劑量組CK-MB極顯著高于空白組(P<0.01)；低劑量組CK-MB顯著高于空白組(P<0.05)。高劑量組、中劑量組LDH極顯著高于空白組(P<0.01)。

表3 造模后15 d的AST、CK、CK-MB、LDH及CTN-T數(shù)據(jù)Table 3 The data of AST、CK、CK-MB、LDH and CTN-T after 15 d of animal models

注：*P<0.05,**P<0.01 vs空白組

Note: Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

由表3可知，中劑量組、低劑量組AST極顯著高于空白組(P<0.01)。中劑量組CK極顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組、中劑量組、低劑量組CK-MB極顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組、中劑量組LDH極顯著高于空白組(P<0.01)；低劑量組LDH顯著高于空白組(P<0.05)。

2.3 病理

小鼠心肌HE染色切片結(jié)果見(jiàn)圖5～8。空白組小鼠心肌纖維粗細(xì)均勻，排列整齊，橫紋清楚，未見(jiàn)變性壞死，心肌間質(zhì)亦無(wú)炎癥反應(yīng)(圖5)；模型高劑量組各只小鼠心肌纖維大范圍變性，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞界限不清，胞漿溶解成粉染顆粒狀，細(xì)胞核分布不均，核增大，可見(jiàn)核仁(圖6)；其中8 d 小鼠心肌纖維出現(xiàn)點(diǎn)灶狀壞死，較多淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7)；其中15 d 小鼠心肌間散在多灶性壞死區(qū)，間質(zhì)水腫，血管充血，較多淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖8)。

圖5 空白組小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.5 The cardiac tissue in mice of black comparison group(HE,×400)

圖6 模型高劑量組小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.6 The cardiac tissue in mice of high dose group(HE,×400)

圖7 模型高劑量組造模后8 d小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.7 The cardiac tissue in mice of high dose group after 8 days(HE,×400)

圖8 模型高劑量組造模后15 d小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.8 The cardiac tissue in mice of high dose group after 15 days(HE,×400)

2.4 死亡率

各組小鼠按相應(yīng)劑量皮下連續(xù)3 d注射ISO后剩余動(dòng)物數(shù)及死亡率見(jiàn)表4。

表4 造模前后動(dòng)物的剩余數(shù)量及死亡率Table 4 The Remaining number and death rate of animals before/after animal models

由表4可知造模后高劑量組剩余動(dòng)物23只，死亡率為42.5%；中劑量組剩余動(dòng)物30只，死亡率為25%；低劑量組剩余動(dòng)物35只，死亡率為12.5%。

3 討論

目前，大、小鼠慢性心肌缺血模型的造模方法、造模劑量及評(píng)價(jià)指標(biāo)尚缺少系統(tǒng)的試驗(yàn)研究，文獻(xiàn)報(bào)道的方法繁多但無(wú)統(tǒng)一的、客觀的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。本文認(rèn)為，慢性心肌缺血模型的是否成模標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)根據(jù)其所應(yīng)用的試驗(yàn)時(shí)間而定，此模型若能在受試藥物較長(zhǎng)的給藥期間內(nèi)維持穩(wěn)定即可判斷此模型成功。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[8-10]很大一部分治療心肌缺血的藥效學(xué)試驗(yàn)給藥時(shí)間均不超過(guò)15 d，本試驗(yàn)針對(duì)此情況設(shè)計(jì)觀察8 d和15 d，這個(gè)時(shí)間長(zhǎng)度基本可以滿足大部分治療給藥試驗(yàn)周期的需求。指標(biāo)選擇上采用ECG、心肌酶譜、肌鈣蛋白及病理觀察，涵蓋了很大一部分試驗(yàn)的常規(guī)需求[11-14]。

本實(shí)驗(yàn)以小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，一般小鼠ECG特點(diǎn)為無(wú)明顯ST段，S波與T波直接平滑相連，人工測(cè)量ST段及J點(diǎn)主觀性較強(qiáng)。故以T高度作為考察指標(biāo)，影響因素較少，準(zhǔn)確度較高，更加客觀。結(jié)果顯示連續(xù)3 d皮下注射ISO 16 mg/kg 的劑量組在造模后24 h、8 d、15 d ECG的T波高度均發(fā)生較為顯著的變化；連續(xù)3 d皮下注射ISO 32 mg/kg 的劑量組在造模15 d時(shí)T波高度變化較為顯著；而連續(xù)3 d皮下注射ISO 8 mg/kg 的劑量組各個(gè)時(shí)間T波高度均無(wú)顯著變化。這說(shuō)明連續(xù)3 d皮下注射ISO 32 mg/kg 和16 mg/kg的劑量都能造成小鼠較持久的心肌缺血癥狀。而8 mg/kg 的劑量效果不顯著。ISO 16 mg/kg 劑量組的ECG在24 h、8 d時(shí)T波高度變化較為顯著，而ISO 32 mg/kg 劑量組在24 h、8 d時(shí)T波高度變化反而不顯著，可能是由于ISO 32 mg/kg 劑量組死亡率較高，一些癥狀嚴(yán)重的個(gè)體死亡了，而ISO 16 mg/kg 劑量組反而保留下一些癥狀嚴(yán)重的個(gè)體，導(dǎo)致ECG變化顯著。三個(gè)劑量組在造模后8 d、15 d時(shí)，心肌酶譜相對(duì)空白組均有顯著性差異，如果單純考察心肌酶譜，這三個(gè)劑量均可使用；只有ISO 32 mg/kg 的劑量組在造模后8 d、15 d出現(xiàn)可見(jiàn)的心肌病理變化。本試驗(yàn)采用16 mg/kg劑量的死亡率為25%，8 mg/kg劑量的死亡率僅為12.5%，而相比其他文獻(xiàn)報(bào)道[15]使用8 mg/kg 劑量的死亡率就已達(dá)到33.3%。原因可能和操作有關(guān)。

目前常見(jiàn)一些實(shí)驗(yàn)采用大鼠尾靜脈注射ISO或垂體后葉素(PIT)造成急性心肌缺血模型[16-17]，本實(shí)驗(yàn)旨在制備慢性心肌缺血模型，不追求使藥物第一時(shí)間達(dá)到最大血藥濃度，短時(shí)間血藥濃度過(guò)高亦可以造成動(dòng)物死亡率過(guò)高，因而未采用靜脈注射，而是采用皮下注射的方式。大鼠皮下多點(diǎn)注射ISO是制備慢性心肌缺血的常用方法，但根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠對(duì)ISO的耐受程度遠(yuǎn)低于小鼠，死亡率較高，有關(guān)大鼠的研究情況將在后續(xù)文章中進(jìn)行報(bào)道。

心肌缺血的表現(xiàn)不僅在于 ECG 的異常,還涉及到一些酶學(xué)指標(biāo)的變化。傳統(tǒng)的心肌酶譜包括AST(生物半衰期20 h，18～36 h達(dá)峰，3～4 d恢復(fù)正常)、CK(生物半衰期17 h，12～24 h達(dá)峰，3～4 d恢復(fù)正常)、CK-MB(生物半衰期13 h，12～24 h達(dá)峰，2～3 d恢復(fù)正常)、LDH(生物半衰期110 h，48～72 h達(dá)峰，7～14 d恢復(fù)正常)用以評(píng)估心肌細(xì)胞性損傷, 其中AST和LDH廣泛存在于全身各組織中，單獨(dú)的AST或LDH升高并不能確認(rèn)為心肌損傷，必須結(jié)合心電圖以及CK、CK-MB等指標(biāo)聯(lián)合判斷；CK是心肌細(xì)胞中重要的能力調(diào)節(jié)酶，由M和B 兩個(gè)亞基組成，形成CK-MM、CK-MB和CK-BB三種同工酶；其中CK-BB主要存在于腦組織中，CK-MM主要存在于骨骼肌中，而CK-MB主要存在于心肌中，故CK-MB特異性最高[18]。CTN-T(生物半衰期2 h，12～96 h達(dá)峰，7-14 d恢復(fù)正常)是收縮蛋白中調(diào)節(jié)蛋白的重要部分，是CTN與原肌球蛋白結(jié)合的部分，其在心肌中的含量較高，而正常人的血液中幾乎檢測(cè)不到CTN-T，對(duì)急性心肌梗死有較高的分辨能力[19]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的考察時(shí)間為8 d和15 d，其中8 d超過(guò)了AST、CK、CK-MB的恢復(fù)時(shí)間，15 d超過(guò)了上述所有標(biāo)志物的恢復(fù)時(shí)間。皮下注射ISO 32 mg/kg、16 mg/kg 及8 mg/kg，8 d及15 d后動(dòng)物血液中的CK-MB較空白組均有顯著性差異，無(wú)論是8 d還是15 d均遠(yuǎn)超過(guò)了CK-MB的恢復(fù)時(shí)間，這說(shuō)明這三個(gè)造模劑量均能造成心肌的持續(xù)損傷。而皮下注射ISO 16 mg/kg劑量組在15 d仍能夠保持AST、CK、CK-MB、LDH顯著升高，說(shuō)明該劑量持續(xù)造成心肌損傷效果較好。

從心電圖及心肌損傷標(biāo)志物的結(jié)果來(lái)看，中劑量組的心電圖改變和心肌損傷均比高劑量組嚴(yán)重，但其死亡率僅為25%，較高劑量組的死亡率42.5%大幅降低。我們推測(cè)是由于高劑量組一些小鼠無(wú)法耐受而死亡，中劑量組則因?yàn)閯┝肯鄬?duì)較低死亡率大幅降低，因而保留的一部分癥狀較重的小鼠。中劑量組死亡率與心電圖及心肌損傷標(biāo)志物改變達(dá)到了相對(duì)較好的平衡。

從病理結(jié)果來(lái)看，高劑量組造模后8 d及15 d的小鼠心肌均出現(xiàn)明顯病理變化，可見(jiàn)以ISO 32 mg/kg造?？稍? d、15 d內(nèi)造成病理性損傷，形成心肌的壞死性炎癥反應(yīng)。中劑量組、低劑量組鏡下均未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變。

綜上所述，小鼠連續(xù)3 d皮下注射ISO 32 mg/kg或ISO 16 mg/kg均能造成慢性心肌缺血模型，可在心電圖、心肌損傷標(biāo)志物及病理形態(tài)三方面均產(chǎn)生顯著改變。此模型造模方法簡(jiǎn)便，維持時(shí)間長(zhǎng)，適合抗慢性心肌缺血藥物較長(zhǎng)期治療給藥的藥效評(píng)價(jià)。而ISO 16 mg/kg的造模劑量死亡率較低并且在心電圖與心肌損傷標(biāo)志物的指標(biāo)上優(yōu)于ISO 32 mg/kg，但并未造成心臟明顯病理性損傷。提示可根據(jù)不同試驗(yàn)預(yù)期選擇性地采用2個(gè)不同造模劑量建立小鼠慢性心肌缺血模型。