侯震濤 冀子中 鄔萬新等

[摘要] 目的 探究胃癌組織中Lgr5和β-catenin蛋白表達的差別及相關(guān)性。 方法 選擇2012年1月～2017年12月間嘉興市第一醫(yī)院80例胃癌患者組織病理標(biāo)本作為觀察組，30例淺表性胃炎患者組織病理標(biāo)本和30例萎縮性胃炎患者組織病理標(biāo)本分別作為對照組，采用免疫組化法檢測Lgr5和β-catenin蛋白的表達。 結(jié)果 Lgr5和β-catenin蛋白在觀察組中的表達率高于對照組，三者之間存在顯著差異（χ2=12.937、13.654，P均<0.05）。Lgr5蛋白在胃癌中的表達與患者的組織分化程度及患者的腫瘤TNM分期存在明顯相關(guān)性（P均<0.05）;β-catenin蛋白在胃癌中的表達與患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的腫瘤TNM分期存在明顯相關(guān)性（P均<0.05）。同時，在胃癌組織中，Lgr5和β-catenin蛋白的表達呈明顯相關(guān)性（rp=0.226，P=0.038）。 結(jié)論 在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Lgr5 和 β-catenin蛋白發(fā)揮著重要作用，二者的檢測對于胃癌的靶向診療意義重大。

[關(guān)鍵詞] Wnt信號通路;胃癌;Lgr5;β-catenin

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）04-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the difference and correlation of Lgr5 and β-catenin protein expression in gastric cancer tissues. Methods Histopathological specimens of 80 gastric cancer patients in Jiaxing First Hospital from January 2012 to December 2017 were selected as observation group. Histopathological specimens of 30 superficial gastritis patients and 30 atrophic gastritis patients were selected as the control group. The expression of Lgr5 and β-catenin protein was detected by immunohistochemistry. Results The expression rates of Lgr5 and β-catenin in the observation group were higher than those in the control group， and there were significant differences among the three groups（χ2=12.937 and 13.654， P<0.05）. The expression of Lgr5 protein in gastric cancer was significantly correlated with the degree of tissue differentiation and the TNM stage of patients（P<0.05）. There was a significant correlation between the expression of β-catenin protein in gastric cancer and whether the patient had lymph node metastasis and tumor TNM stages（P<0.05）. At the same time， the expression of Lgr5 and β-catenin protein was significantly correlated in gastric cancer tissues（rp=0.226， P=0.038）. Conclusion Lgr5 and β-catenin proteins play an important role in the development of gastric cancer. The detection of these two is of great significance for the targeted diagnosis and treatment of gastric cancer.

[Key words] Wnt signaling pathway; Gastric cancer; Lgr5; β-catenin

胃癌是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因，盡管目前在手術(shù)、化療、放療、靶向分子治療等方面均取得了長足進展，但晚期胃癌患者的5年生存率仍然較低[1]。因此，識別新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，對于進一步闡明胃癌進展的機制及其預(yù)防和治療至關(guān)重要。近年來，腫瘤干細胞（CSCs）對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要性得到了公認，CSCs是具有自我更新功能的多能細胞，對胃癌的增殖、轉(zhuǎn)移具有重要作用[2]，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活參與了胃癌CSCs的調(diào)控[3]。在人類的進化過程中，Wnt/β-catenin信號通路高度保守，目前普遍認為，Wnt /β-catenin信號通路通過參與多種人類生理活動與腫瘤的形成，胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。作為Wnt信號通路的重要組成部分之一，富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5（Lgr5）在多種腫瘤中存在異常表達，參與了CSCs增殖分化異常的過程，是不可或缺的重要因素之一[5]。作為Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵蛋白，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在Wnt信號通路中扮演著重要的角色，其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[6]。本研究通過聯(lián)合檢測胃癌、萎縮性胃炎和淺表性胃炎組織中Lgr5和β-catenin蛋白的表達，對二者在胃癌進展過程中發(fā)揮的作用進行探討，并最終為胃癌的診療以及改善患者的預(yù)后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究隨機選取的標(biāo)本均取自嘉興市第一醫(yī)院2012年1月～2017年12月間門診或住院患者80例，所有胃癌組織標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實，包括男49例，女31例，年齡37～82歲。同時隨機選取淺表性胃炎患者組織標(biāo)本30例，包括男14例，女16例，年齡27～71歲;隨機選取萎縮性胃炎患者組織標(biāo)本30例，包括男14例，女16例，年齡33～73歲。二者組織標(biāo)本均取自胃鏡活檢并經(jīng)病理學(xué)證實。本次研究所選取的患者病理組織標(biāo)本均保存完好并具有完善的臨床資料。

1.2主要試劑

Lgr5蛋白抗體試劑，購自英國Abcam公司，克隆號：ab75732，工作濃度：1∶100;β-catenin蛋白抗體試劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，克隆號：UMAB 15，工作濃度：1∶100。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法? 利用免疫組化染色SP法對Lgr5和β-catenin蛋白的表達進行檢測，陽性對照選取已知陽性的切片，陰性對照選取每種抗體的Tris作為一抗的代替。本研究的所有免疫組化方法均按照說明書步驟嚴格進行。

1.3.2 判定方法? ①Lgr5結(jié)果判定：主要通過參照Fromo-witz綜合計分法[7]進行雙盲半定量觀察分析，整個結(jié)果判斷過程由2位工作經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進行判讀，Lgr5的主要陽性著色部位位于細胞膜及細胞質(zhì)，呈淺黃色、棕黃色及深褐色顆粒。隨機在400倍高倍顯微鏡下選取5個視野并在每個視野中計數(shù)200個細胞，通過觀察細胞的著色情況進行計分[8，9]：基本不著色為0分，淺黃計為1分、棕黃色計為2分、深褐色計為3分。同時計算著色細胞占總計數(shù)細胞的百分比，根據(jù)著色細胞占比情況進行計分：無陽性細胞計0分，1%～25%計1分，26%～49%計2分，≥50%計3分。最后計算總積分，將二者所得計分相加：0～1分計為陰性（-），2分及以上計為陽性（+），當(dāng)二者觀察結(jié)果相差大于10%提示差異過大，則需2位病理科醫(yī)師對標(biāo)本情況進行重新評定。②β-catenin結(jié)果判定：正常胃黏膜上皮細胞β-catenin蛋白主要定位于細胞膜及細胞間質(zhì)，表達陽性時多呈黃色，而細胞核和細胞質(zhì)中β-catenin的表達多為陰性。胃癌腫瘤細胞中細胞膜上β-catenin的表達呈明顯減弱或消失，同時胞質(zhì)胞核出現(xiàn)異常染色或完全陰性染色。本研究中以細胞質(zhì)和/或細胞核中的黃色顆粒作為β-catenin表達的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。隨機在400倍高倍顯微鏡下選取5個視野并在每個視野中計數(shù)200個細胞，通過觀察細胞的著色情況進行計分[10-11]：無黃色：0分;淡黃色：1分;棕黃色：2分;棕褐色：3分。根據(jù)著色細胞占比情況進行計分：陽性細胞<10%為0 分; 10%～50%為1分;51%～75%為2分;>75%為3分。每張切片的染色總分值為二者乘積，0分計為陰性，計為“-”;總分值1分及以上為陽性，計為“+”，當(dāng)二者觀察結(jié)果相差大于10%提示差異過大，則需兩位病理科醫(yī)師對標(biāo)本情況進行重新評定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本次研究采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法;采用列聯(lián)系數(shù)分析Lgr5和β-catenin蛋白在胃癌組織中表達的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組Lgr5和β-catenin的表達比較

2.2不同病理特征的胃癌患者Lgr5和β-catenin的表達比較

Lgr5蛋白在胃癌中的表達與患者的組織分化程度及腫瘤TNM分期存在明顯相關(guān)性（P均<0.05）;β-catenin蛋白在胃癌中的表達與患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的腫瘤TNM分期存在明顯相關(guān)性（P均<0.05）。同時，本次研究發(fā)現(xiàn)Lgr5和β-catenin均與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤深度等無明顯相關(guān)性（P均>0.05）。見表2。

2.3 胃癌中Lgr5和β-catenin表達的關(guān)系

3 討論

胃癌是一種十分常見的惡性腫瘤，同時是全世界癌癥死亡最常見的原因之一，在亞洲地區(qū)發(fā)病率較高[12]。與許多其他類型的癌癥相同，多種遺傳和分子因素可以影響胃癌的發(fā)生和進展過程，主要包括多種癌基因的激活和抑癌基因的抑制。胃癌早期無明顯臨床癥狀，患者就診后往往提示胃癌晚期，后期療效及預(yù)后不佳。對于可切除的胃癌患者，手術(shù)和輔助放化療是治療的主要途徑，然而，盡管接受了標(biāo)準(zhǔn)的治療，許多胃癌患者仍有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前普遍認為CSCs起源于正常的干細胞或祖細胞[13]，被認為是胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療失敗的重要原因，許多研究發(fā)現(xiàn)CSCs可能在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，CSCs相關(guān)的特異性標(biāo)志物可能是靶向治療和預(yù)后預(yù)測的關(guān)鍵[14]。Wnt/β-catenin信號通路是生物體內(nèi)重要的信號通路之一，在人體的多種生理活動方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和細胞極性等控制胚胎發(fā)生過程和調(diào)控人體穩(wěn)態(tài)[15]。在大量的散發(fā)性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了Wnt/β-catenin信號通路的活化突變，包括乳腺癌、白血病和胃腸道癌等，Wnt/β-catenin信號通路對促進CSCs的自我更新和誘導(dǎo)腫瘤細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）具有重要的意義，其異常激活可以促進多種腫瘤的轉(zhuǎn)移與進展，與胃癌腫瘤細胞的增殖和細胞凋亡減少有關(guān)[16-18]。因此，作為Wnt/β-catenin信號通路不可或缺的重要組成部分，Lgr5和β-catenin在胃癌的發(fā)生發(fā)展、靶向治療和預(yù)后預(yù)測方面意義重大。

Lgr5，又名GPR49，在人體內(nèi)分布廣泛，是G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族的成員之一，研究指出Lgr5是Wnt/β-catenin信號通路的重要組成部分之一，在包括食管腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌的多種人類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)異常表達[19]。目前普遍認為Lgr5是胃腸道惡性腫瘤中的干細胞標(biāo)志物之一[20]，作為Wnt通路的重要組成部分在啟動腫瘤生長和推動遠處轉(zhuǎn)移中起著重要作用[21]。在人類染色體上，Lgr5 基因定位于12號染色體的q22～23處，由21個內(nèi)含子和22個外顯子組成[22]。Lgr5蛋白一共包括907個氨基酸分子，另一方面，Lgr5蛋白具有一處特征性的外功能區(qū)域，該區(qū)域含有17個富含亮氨酸的重復(fù)序列。Lgr5在正常人類組織中只在成人干細胞的細胞表面呈低水平表達[23]，多位于隱窩基底部，在胃腸上皮化生病變中和胃癌中Lgr5陽性表達顯著上調(diào)[24]，并且與幽門螺旋桿菌感染和EMT密切相關(guān)[25-26]。目前Lgr5+細胞已經(jīng)被證明具有腫瘤啟動細胞或CSCs的特性，在胃癌的發(fā)生和進展過程中保留了自我更新的能力[27]。有報道指出[28]，通過殺死胃癌組織中的Lgr5陽性細胞，在體外和體內(nèi)可以幾乎完全抑制胃癌細胞的增殖。Gong等[29]發(fā)現(xiàn)使用Lgr5靶向抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）可以有效地根除胃腸道癌細胞并抑制體內(nèi)腫瘤的生長和復(fù)發(fā)，同時可以有效的治療胃腸腫瘤并消除胃癌CSCs。因此，Lgr5是一個新的靶點，Lgr5的拮抗劑或人類Lgr5的單克隆抗體可能在臨床上適用于胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療，基于Lgr5的靶向治療可能是胃癌診療和改善患者預(yù)后的重要途徑。本研究結(jié)果顯示Lgr5蛋白在淺表性胃炎、萎縮性胃炎及胃癌中的表達逐次升高，三者之間存在顯著差異（χ2=12.937，P<0.05）。Lgr5的陽性表達與患者的TNM分期及組織分化程度存在明顯相關(guān)性（P均<0.05）。目前的研究對Lgr5蛋白在Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胃癌CSCs的增殖分化以及胃癌的發(fā)生和進展過程中的具體作用機制仍然尚未完全明確，仍然需要未來進一步的研究。

β-catenin是連環(huán)素家族的一員，在多種生理活動中發(fā)揮重要的作用，是Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心組件，目前普遍的研究指出其表達上調(diào)可以誘導(dǎo)Wnt靶基因激活，從而促進腫瘤的發(fā)生和進展[30]。β-catenin蛋白在正常人類組織中主要定位于細胞膜，也有一部分β-catenin蛋白可見于細胞間質(zhì)，主要通過結(jié)合細胞膜上的E-鈣黏蛋白維持人體正常的生理功能，其中一小部分的β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生磷酸化并最終在蛋白酶體的作用下逐漸降解[31]。而在多種人類腫瘤中，β-catenin蛋白可出現(xiàn)異常表達，通常表現(xiàn)為在細胞膜處β-catenin表達呈現(xiàn)明顯減弱和（或）缺失的趨勢，同時在細胞質(zhì)、細胞核等處的表達較前顯著增強[32]。眾所周知，β-catenin核積累是Wnt信號通路轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵性標(biāo)志，此時異常激活的Wnt相關(guān)蛋白與多種細胞表面受體結(jié)合，進而導(dǎo)致糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β的生物活性受到抑制，使得β-catenin向核內(nèi)移位，細胞核中不斷積累的β-catenin蛋白最終與下游因子結(jié)合并激活Wnt/β-catenin信號通路下游相關(guān)靶基因，最終導(dǎo)致多種人類腫瘤的發(fā)生及進展[33]。同時有報道指出，通過增加β-catenin的降解可以顯著抑制EMT過程，減少胃癌細胞在體外的遷移和侵襲以及體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能，有效改善胃癌患者預(yù)后[34]。另一方面，Xi等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默胃癌細胞中Lgr5的表達后，β-catenin的表達出現(xiàn)顯著降低，表明針對Lgr5的沉默和干擾可能會影響Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而降低β-catenin進入細胞核的積累和易位，并可能最終抑制胃癌的侵襲，提示二者之間具備相關(guān)性。因此，對于評價胃癌生物學(xué)行為，β-catenin可以作為較好的指標(biāo)并為胃癌的診療提供新的思路。本研究結(jié)果顯示β-catenin蛋白的異常表達在淺表性胃炎組和萎縮性胃炎組以及胃癌組中的表達逐次升高，三者之間存在顯著差異（χ2=13.654，P<0.05）。β-catenin蛋白在胃癌中的表達與患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的腫瘤TNM分期存在明顯相關(guān)性（P均<0.05）。因此，β-catenin是人類胃癌發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一，進一步研究β-catenin的功能和調(diào)控機制是必要的，這將有助于更好地理解胃癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移，有助于闡明胃癌治療的新策略。

此外，本次研究結(jié)果還顯示，作為Wnt /β-catenin信號通路的關(guān)鍵靶基因和組成部分，Lgr5和β-catenin之間關(guān)系密切，在胃癌中的表達呈明顯相關(guān)性，推測在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中Lgr5和β-catenin可能具有協(xié)同作用。近年來，腫瘤治療中一個主要的難題在于需要瞄準(zhǔn)并消滅腫瘤，同時最小化對正常組織的不希望的毒性和損傷。因此，尋找可靠、敏感的腫瘤標(biāo)志物和靶點對于胃癌的診療和預(yù)后極為重要。

綜上所述，本次研究指出了Lgr5和β-catenin作為靶向胃癌CSCs和抑制腫瘤生長復(fù)發(fā)的治療靶點的巨大潛力，有望為未來胃癌診療方法的開發(fā)提供新的方向。

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（收稿日期：2018-09-21）