王玨，李霜雯，呂曉亮，田宇明

(大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,遼寧 大連 116023)

松材線蟲(chóng)病(PWD)是由松材線蟲(chóng)侵染引起，一段時(shí)間內(nèi)可以使松樹(shù)枯死的一種嚴(yán)重森林病害，該病又稱為松材線蟲(chóng)萎蔫病、松樹(shù)萎蔫病、松樹(shù)枯萎病，被稱為“松樹(shù)的癌癥”[1]，具有發(fā)病致死速度快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點(diǎn)，是嚴(yán)重威脅全世界林業(yè)生產(chǎn)的重大檢疫性病害之一[2]。松材線蟲(chóng)病最早于1905年在日本九州長(zhǎng)崎發(fā)現(xiàn)，于1982年首次在我國(guó)南京市中山陵黑松上發(fā)現(xiàn)[3]，于2016年在大連沙河口區(qū)大頂山發(fā)現(xiàn)。由于黑松是大連市南部風(fēng)景林和沿海防護(hù)林的主要樹(shù)種，而黑松又是松材線蟲(chóng)病的易感染樹(shù)種，疫情得不到良好的控制，將直接威脅大連市6.7萬(wàn)hm2松林的安全。由于該病由松材線蟲(chóng)引起，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)很好的根除方法，唯有通過(guò)早期診斷和檢測(cè)，設(shè)立和建設(shè)無(wú)病區(qū)，快速清理疫木以防疫情擴(kuò)散[4]。松材線蟲(chóng)的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)如形態(tài)學(xué)等方法在檢測(cè)過(guò)程或多或少存在一定的局限性[5]，分子檢測(cè)技術(shù)則具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)[6]，本研究首次對(duì)大連地區(qū)黑松枯萎病發(fā)病情況進(jìn)行廣泛調(diào)查并對(duì)病原線蟲(chóng)進(jìn)行多方面鑒定，以期為松材線蟲(chóng)病未來(lái)的防治提供相應(yīng)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn)及采樣方法

2017年10月到2018年3月，對(duì)遼寧省大連市黑松枯死的7個(gè)典型地區(qū)作為樣地進(jìn)行調(diào)查(濱海路西段、動(dòng)物園、中山青云林海、中山棒棰島、西崗捷山、沙河口大頂山、甘井子翡翠春城)，采用系統(tǒng)抽樣方法進(jìn)行樣本的采集，每10～15 m確定一株枯死樹(shù)進(jìn)行采樣。本次調(diào)查共采集494株黑松樣本，用于分離鑒定病原松材線蟲(chóng)。測(cè)量記錄每株樣木的胸徑和樹(shù)高，采樣部位為樣木坡下方向距地1.3 m胸高處，采集量約80 g，裝入標(biāo)本袋，及時(shí)將樣品冷藏待檢。

1.2 線蟲(chóng)的分離

采用貝爾曼漏斗法[7]，將采集的木樣劈成長(zhǎng)度小于1 cm，寬度小于0.5 cm的小木塊，每個(gè)樣品取樣7.5 g，重復(fù)3次，單層紙巾包好，純凈水浸泡12 h，漏取2 mL左右線蟲(chóng)懸浮液放入離心管中，吸取管底線蟲(chóng)液用于形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。分離過(guò)后的木塊、多余蒸餾水和漏斗進(jìn)行120 ℃高溫?zé)o害化處理。

1.3 形態(tài)鑒定

用100 μL移液槍吸取離心管底部線蟲(chóng)懸浮液滴至載玻片，解剖鏡下挑取雌、雄蟲(chóng)各1頭以上，將其置于酒精燈火焰上方加熱3～5 s，線蟲(chóng)加熱殺死后加蓋玻片，制成臨時(shí)玻片，于顯微鏡下觀察線蟲(chóng)主要形態(tài)特征(口針、食道球、陰門、陰門蓋、交合刺、交合傘與尾端形態(tài)等)并進(jìn)行初步鑒定。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

用10 μL移液槍在顯微鏡下挑取形態(tài)無(wú)法確定的線蟲(chóng)，從TAKARA公司購(gòu)買DNA制備試劑盒，按照試劑盒要求步驟提取線蟲(chóng)DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系共50 μL，包括正反引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 35.75 μL，dNTP Mix 4 μL，dTaq酶0.25 μL，10×Taq Buffer 5 μL。松材線蟲(chóng)特異性引物為東北林業(yè)大學(xué)松材線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送(上游引物：GATGGCGGTTCGATTCGCG,下游引物：TGGCTGGTCTCATCTGTCGG)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；采用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，電壓為130 V，電流為130 mA ，分析DNA片段的長(zhǎng)度，觀察并照相。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生化公司雙向測(cè)序。登錄NCBI網(wǎng)站中的BLAST頁(yè)面將測(cè)序結(jié)果與已登錄的序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲(chóng)鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)觀察結(jié)果 成蟲(chóng)頭部均具有明顯的溢縮，具口針和中食道球。雄蟲(chóng)熱殺死后蟲(chóng)體呈“J”形，強(qiáng)烈腹彎，側(cè)面觀呈爪狀，體前端與雌蟲(chóng)相似，尾部有交合刺，尾端尖細(xì)，交合刺弓狀，成對(duì)，基頂高圓，喙突銳尖、交合刺遠(yuǎn)端具小盤狀突，尾端腹面觀可見(jiàn)交合傘，多呈卵圓形，形態(tài)多變。雌蟲(chóng)熱殺死后蟲(chóng)體略向腹面彎曲，成大寫的C形，唇區(qū)高，溢縮顯著，口針細(xì)長(zhǎng)，基部略膨大，中食道球卵圓形，鱷梨狀，占體寬2/3左右，瓣門清晰，陰門位于蟲(chóng)體中后部，大約體長(zhǎng)70%處，陰門蓋明顯，像指甲形，附在陰門上，尾部指圓形，無(wú)尾尖突。

形態(tài)觀察結(jié)果表明，雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的形態(tài)特征符合松材線蟲(chóng)的鑒定特征，由于松材線蟲(chóng)的雄蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的雄蟲(chóng)形態(tài)很接近，因此辨認(rèn)松木內(nèi)松材線蟲(chóng)的主要依據(jù)是雌蟲(chóng)。

圖2 部分PCR凝膠電泳

2.1.2 分子鑒定結(jié)果 選擇松材線蟲(chóng)序列特異性引物，以黑松疑似松材線蟲(chóng)的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得完全一致的序列,測(cè)序結(jié)果片段為105 bp。將序列在NCBI上比對(duì)結(jié)果顯示，黑松中分離的線蟲(chóng)與松材線蟲(chóng)多個(gè)登錄序列相似度為100%(如MK：292122.1)。綜上所述，以上分子測(cè)序結(jié)果結(jié)合樣地中黑松受害特征和松材線蟲(chóng)特征，綜合判斷大連地區(qū)黑松枯萎病原線蟲(chóng)為松材線蟲(chóng)。

圖3 部分PCR產(chǎn)物序列結(jié)果

圖4 NCBI在線比對(duì)部分結(jié)果

2.2 松材線蟲(chóng)調(diào)查結(jié)果

為全面了解大連地區(qū)松材線蟲(chóng)病情況，本次調(diào)查涉及中山區(qū)、西崗區(qū)、沙河口區(qū)、甘井子區(qū)四個(gè)行政區(qū)，在各區(qū)具有代表性的地塊內(nèi)選擇7個(gè)樣地，涉查面積合計(jì)約57.5 hm2。調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1。調(diào)查的枯死黑松數(shù)量為494株，通過(guò)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，其中有79株黑松有松材線蟲(chóng)，每個(gè)地區(qū)線蟲(chóng)檢出率差異較大，有松材線蟲(chóng)株率平均為16.0%。

表1 各樣地黑松枯死調(diào)查結(jié)果

3 結(jié)論與討論

黑松較耐寒、耐干旱、耐瘠薄及對(duì)鹽堿土抗逆性較強(qiáng)，較抗海風(fēng)，也可在海灘鹽土地方生長(zhǎng)，耐海風(fēng)和海剎，能與多種樹(shù)構(gòu)成針闊混交林，在沿海造林總體表現(xiàn)較好。大連地區(qū)的黑松原產(chǎn)日本，從山東舟山群島引入到大連已有70多年歷史，經(jīng)過(guò)幾十年的引種栽培，已形成了大連地區(qū)風(fēng)景林和沿海防護(hù)林主林帶，為大連生態(tài)建設(shè)和林業(yè)發(fā)展起到了重要作用[8]。

調(diào)查明確了大連地區(qū)2017—2018年黑松感染松材線蟲(chóng)的基本狀況，本次調(diào)查涉及大連各區(qū)具有代表性的地塊，通過(guò)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合樣地中黑松受害特征和松材線蟲(chóng)特征，綜合判斷大連地區(qū)黑松枯萎病原線蟲(chóng)為松材線蟲(chóng)，在抽樣的黑松中感染率平均為16.0%。自2016年大連市在黑松上發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)以來(lái)，已經(jīng)造成上千畝松樹(shù)死亡，且尚無(wú)很好的根除方法，因此為防止大連市松材線蟲(chóng)病疫情擴(kuò)散，保障大連市森林生態(tài)安全，加強(qiáng)病害的早期診斷和檢測(cè)技術(shù)尤為重要[9]。針對(duì)松材線蟲(chóng)病的防治還需在前期鑒定方法方面進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期在未來(lái)檢測(cè)中縮短鑒定時(shí)間和簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方式。