顏新建，李高峰△，唐 梅，楊小平

(1. 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院腫瘤科，湖南 株洲 412000；2. 湖南師范大學醫(yī)學院 小分子靶向藥物研究與創(chuàng)制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410013)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中發(fā)病率高居第4，早期膀胱癌預后一般較好，但發(fā)展到中晚期整體預后較差，治療成本高，防治形勢不容樂觀[1]。因此深入探討膀胱癌的發(fā)病機理及尋求新的治療方法尤為重要。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成棕櫚酸酯的關鍵酶，為機體儲存能量，參與細胞脂質代謝。FASN在正常人體組織中除脂肪組織、肝組織、新生兒肺臟外表達很低，而研究報道多種腫瘤如乳腺癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌等存在FASN高表達，可見FASN與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，F(xiàn)ASN可能是潛在的腫瘤治療靶點[2-5]。目前其在膀胱癌中的報道少見，因此本實驗組就FASN在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達，利用siRNA技術抑制FASN表達后對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

從中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院病理科收集45例石蠟塊，包括30例膀胱癌電切術后獲得的膀胱癌組織及15例膀胱造瘺術后活檢獲得的正常膀胱組織，用作對照，蠟塊連續(xù)切片用于后續(xù)免疫組化，組織病理結果經我院2位病理科醫(yī)生證實；以上組織均得到被取材人口頭同意，并征得醫(yī)院倫理委員會批準及經患者同意；人膀胱癌細胞系UMUC3由郭鵬教授饋贈；反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒、羊抗兔二抗購自天根生化科技公司；脂質體2000購自美國QIAGEN公司；FASN siRNA及無義siRNA由擎科生物科技有限公司合成；兔抗人FASN抗體為美國CST公司產品。胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、牛血清蛋白購自美國Gibco公司，標準蛋白mark為Thermo公司產品。

1.2 免疫組織化學法檢測膀胱癌組織中FASN蛋白表達

采用免疫組化PV-6000法依次對組織切片行脫蠟、水化，枸櫞酸鹽修復液修復抗原、血清封閉，一組滴加FASN抗體(1∶1 000)，另一組滴加PBS作為對照，4℃孵育過夜，PBS清洗3次，加二抗(辣根過氧化物酶標記二抗)室溫孵育1 h,DAB液顯色，蘇木素行核復染，水洗并觀察染色程度，分化、脫水、封片后顯微鏡下觀察。FASN蛋白表達陽性表現(xiàn)為細胞質呈棕黃色分布，根據陽性細胞所占比例來確定FASN蛋白表達強弱：(1)無陽性細胞(-)；<25%細胞呈陽性(+)；>25%細胞呈陽性(++)；>50%細胞為強陽性(+++)。

1.3 UMUC3細胞培養(yǎng)及轉染

人膀胱癌UMUC3細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，取生長狀態(tài)好的細胞用于后續(xù)實驗。將200 μl細胞懸液包含8×104cells接種于96孔板，當細胞融合達到90%時進行轉染，利用脂質體2000將FASN siRNA及無義siRNA轉染細胞，依據轉染siRNA不同分siFASN組(轉染FASN siRNA)及siControl組(轉染無義siRNA)，繼續(xù)培養(yǎng)，免疫熒光法鑒定轉染效果。

1.4 MTT法檢測UMUC3細胞的增殖活力

收集對數生長期細胞，混勻接種于96孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，待細胞長至對數生長期時轉染FASN siRNA和無義siRNA，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后除去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入50 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，隨后吸去培養(yǎng)基加150 μl二甲基亞砜，避光振蕩10 min,每組細胞實驗重復3次，于酶標儀490 nm波長處檢出每孔OD值,計算細胞增殖抑制率。

1.5 細胞劃痕實驗檢測UMUC3細胞的遷移能力

接種5×105cells于6孔板，按照脂質體2000轉染說明書方法進行轉染，轉染24 h后觀察細胞生長情況，待細胞貼壁后，用10 μl槍頭劃痕，劃線過程中使槍頭保持垂直，PBS清洗1遍，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃后0 h、24 h、48 h拍照，每組細胞實驗重復3次。劃痕遷移能力=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100。

1.6 Transwell實驗檢測UMUC3細胞的侵襲能力

收集胰酶消化懸浮的細胞，無血清培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，細胞計數，調整細胞密度為1.5×105cells/ml。使用10 μm孔徑的Transwell小室進行細胞侵襲力檢測，將200 μl細胞懸液包含3×104個細胞加入24孔板Transwell小室中。在24孔板下室加入600 μl完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后用濕棉簽擦去小室內的細胞，小室底膜用結晶紫染色，PBS清洗小室，徹底晾干后顯微鏡下拍照。每片隨機選取5個100×視野計數，取平均數進行分析。

1.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測UMUC3細胞FASN mRNA表達

根據Trizol說明書提取細胞總RNA。反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA,FASN引物序列(由擎科生物科技有限公司合成)為：上游引物：5＇-TGCCCTGAGCTGGACTACTT-3＇，下游引物：5＇-AAAGCTGCTCAGGACCATGT-3＇；RT-PCR反應條件：95℃ 150 s，95℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s共循環(huán)35次。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算FASN mRNA相對表達水平。

1.8 蛋白印跡法(Western blot)檢測UMUC3細胞FASN蛋白表達

按試劑盒說明書操作提取總蛋白，BCA法測定細胞蛋白濃度。每樣本100 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，5%脫脂奶粉TBST液封閉1 h，一抗雜交(FASN,1∶1 000；β-actin,1∶ 5 000)，4℃孵育過夜，清洗，二抗(羊抗兔1∶ 5 000；羊抗鼠 1∶5 000)37℃孵育1 h,暗室中顯影，Image J軟件分析蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 FASN蛋白在膀胱癌組織中的表達情況

免疫組化結果顯示FASN蛋白在膀胱癌組織中過表達，表現(xiàn)在細胞質中呈棕黃色分布(圖1，見彩圖頁Ⅲ)，30例膀胱癌組織中有18例FASN蛋白表達陽性，而15例正常膀胱組織中均無FASN蛋白陽性表達，膀胱癌組織中FASN蛋白陽性率(60.0%)顯著高于正常膀胱組織(0.0%，P=0.000),且膀胱癌組織中FASN蛋白表達與病理分期及分級密切相關，F(xiàn)ASN蛋白陽性表達率隨病理分期、分級的增高而增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 表1)。

Tab. 1 Expression levels of FASN protein in bladder cancer and normal bladder tissues (n=45)

GroupnFASN(+)FASN(-)χ2PNormal bladder tissue1501515.0000.000??Bladder carcinoma tissue301812 Pathological stageTa-T1T2-T42371171206.0870.014# Pathological gradeG1G2G3141245949307.2320.027△

**P<0.01vsnormal bladder tissue group;#P<0.05vsTa-T1 group;△P<0.05vsG1 group

2.2 FASN轉染效果鑒定及對 FASN表達影響

篩選、鑒定轉染成功的細胞株，觀察 siFASN組和siControl組細胞，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白在兩組細胞胞質中均有不同程度的表達，同等大小視野下siFASN組熒光蛋白表達量明顯少于siControl組(P<0.05，圖2，見彩圖頁Ⅲ)；RT-PCR結果示siFASN組、siControl組FASN mRNA相對表達量分別為1.17±0.11，0.42±0.13；siFASN組細胞FASN mRNA水平明顯低于siControl組，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05，表2)，Western blot結果示siFASN組、siControl組FASN蛋白相對表達量分別為：0.96±0.11，0.18±0.08，siFASN組細胞幾乎無FASN蛋白表達(圖3)，轉染效果好，與siControl組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig. 3 FASN expression changes after transfection of FASN siRNA in UMUC3 cells (n=3)

2.3 下調FASN表達對UMUC3細胞增殖的影響

MTT檢測結果顯示siFASN組細胞在48 h、72 h時的增殖抑制率分別為：38.12%±1.44%、58.33%±3.52%，siControl組細胞在48 h、72 h時的增殖抑制率分別為：21.97%±1.39%、30.83%±1.92%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)；膀胱癌細胞轉染FASN siRNA后生長抑制明顯，且具有時間依賴性。

2.4 下調FASN表達對UMUC3細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示在24 h、48 h siFASN組細胞遷移距離較siControl組短(圖4)，siFASN組、siControl組細胞平均遷移能力分別為：20.44±1.47、 79.04±2.11，siFASN組細胞的遷移能力較siControl組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

Tab. 2 The FASN mRNA, proliferation and migration ability changes after transfecting FASN siRNA into UMUC3 cell lines n=3)

*P<0.05vsthe siControl group

2.5 下調FASN表達對UMUC3細胞侵襲能力的影響

Transwell試驗結果顯示siFASN組、siControl組平均過膜細胞數分別為66.70±2.01、175.10±2.14,siFASN組平均過膜細胞數較siControl組明顯減少，即siFASN組細胞的侵襲能力較siControl組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。

Fig. 4 Cell migration ability changes after transfection of FASN siRNA in UMUC3bladder cancer cells (Inverted microscope × 40)

*Pvsthe siControl group

3 討論

膀胱癌是我國男性發(fā)病率第6位的流行性惡性腫瘤[6]，早期階段預后一般較好，但發(fā)展到中晚期常規(guī)治療療效欠佳，靶向治療有望成為新的突破口。目前已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的生物代謝方式與正常細胞不同，特別是糖代謝和脂質代謝，研究證實腫瘤細胞自身合成的脂肪酸占其所有脂肪酸的90%以上，腫瘤細胞可通過WarBurg效應在產能的同時生成大量的乙酰輔酶A(CoA)[7]，乙酰輔酶A及丙二酰輔酶A是脂肪酸合成酶(fatty acid synthase FASN)的底物，F(xiàn)ASN催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成長鏈脂肪酸，這些長鏈脂肪酸隨后轉化為對于腫瘤細胞生物膜及脂質合成、蛋白修飾定位、信號轉導等至關重要的代謝脂質，為腫瘤細胞增殖、侵襲轉移提供優(yōu)越條件，發(fā)揮其惡性生物學行為[8,9]，F(xiàn)ASN對于腫瘤細胞異常代謝尤其是脂質代謝至關重要，研究FASN對腫瘤的發(fā)病機制及干預其生物學行為等具有十分重大的意義。

目前，F(xiàn)ASN被報道在多個瘤種如胰腺癌、結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌中過表達，F(xiàn)ASN在腫瘤組織中過表達而在絕大多數正常組織中低表達或無表達的特性使其有望成為新的腫瘤治療靶點。LIANG SUN等[10]用Western blot法發(fā)現(xiàn)胃癌組織中FASN蛋白高表達，隨后用siRNA技術發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)ASN可通過mTOR/GLIL信號通路抑制胃癌細胞的增殖、轉移。JIAOJIAO GONG等[11]也有類似的發(fā)現(xiàn)，體外實驗表明抑制FASN可以有效干擾腫瘤細胞的增殖、浸潤轉移等。本研究采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)FASN在膀胱癌組織中過表達，且與病理分期及分級密切相關，F(xiàn)ASN陽性表達率隨著病理分期和分級的增高而升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與鄧雷弘等[12]研究結果一致，這提示FASN表達可能是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中一個重要的分子事件，F(xiàn)ASN陽性表達率與膀胱癌的浸潤深度、轉移密切相關，F(xiàn)ASN對鑒別膀胱癌惡性分型及分期可能有一定的作用，由于本研究組織數量偏少，這一結果還需大樣本研究佐證。

進一步研究下調FASN表達對UMUC3膀胱癌細胞生物學特性的影響，相比siControl組,我們發(fā)現(xiàn)siFASN組細胞FASN表達在蛋白質水平和mRNA水平均明顯下降，siFASN組細胞的增殖、遷移、侵襲能力均明顯下降(P<0.05)，抑制FASN表達使膀胱癌UMUC3細胞各項生物學功能均下調，與LIANG SUN、JIAOJIAO GONG等的研究結果一致，由于其較高的靶向性，這一結果提示抑制FASN表達可能高效的抑制癌細胞的生長，而無明顯的副作用。已有研究表明抑制FASN表達可使腫瘤細胞出現(xiàn)脂質代謝紊亂，自身合成脂肪酸的能力下降，腫瘤細胞因脂肪酸供應不足而出現(xiàn)脂質饑餓，使其失去生長優(yōu)勢條件，影響其各項生物學功能，最終表現(xiàn)為腫瘤細胞生長、侵襲及轉移能力的廣泛抑制。FASN介導的腫瘤細胞特殊的脂質代謝方式受多條信號通路調控，研究最多的是PI3K/AKT通路[13, 14]，PI3K/AKT信號通路與細胞增殖、分化、代謝密切相關，細胞表型惡化與PI3K/AKT信號通路異常激活相關，F(xiàn)ASN基因被認為是PI3K/AKT信號通路的一個下游基因。LIGONG CHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)下調FASN表達可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活性，上游基因異常激活如腫瘤相關致病因素使FASN過表達，從而改變細胞脂質代謝方式利于細胞惡變，并為其增殖、侵襲、轉移行為等提供優(yōu)勢條件。抑制FASN可能通過抑制PI3K/AKT等相關通路活性影響細胞代謝和生物學行為從而發(fā)揮抗腫瘤效應。目前FASN抑制劑已廣泛用于抗腫瘤研究，頻繁報道出新型FASN抑制劑，如生物檳郎堿可顯著降低脂肪細胞內FASN蛋白的表達[15]，影響其脂質代謝；部分藥物如TVB-2640在抗腫瘤中的有效性及安全性在I期臨床試驗中已有初步探討[16]，目前來看FASN抑制劑具有良好的應用前景和發(fā)展空間,期待有大樣本的臨床研究。

總之，本研究首先在組織學水平上發(fā)現(xiàn)FASN在膀胱癌組織中過表達而在正常膀胱組織中無表達，進一步探究發(fā)現(xiàn)下調FASN表達能抑制膀胱癌UMUC3細胞的增殖、遷移、侵襲能力，F(xiàn)ASN在膀胱癌中具有較高的靶向性，使FASN抑制劑有可能在高效殺傷腫瘤細胞的同時不產生嚴重的毒副作用，本文的研究結果可為FASN抑制劑的后續(xù)研究提供理論基礎，F(xiàn)ASN可能是膀胱癌潛在的治療靶點，抑制FASN表達有望成為一種新的膀胱癌治療方法。