朱文祥，劉必勇，劉洪茂，穆柯瀚，姬艷麗，徐德祥

近年來(lái)，鎘的雄性生殖毒性問(wèn)題受到越來(lái)越多的重視，其生殖毒性作用的主要靶器官是睪丸。鎘能引起成年雄性大鼠或小鼠發(fā)生明顯的睪丸損傷、精子數(shù)量和活力降低甚至不育[1-3]。睪酮是一種對(duì)雄性生殖系統(tǒng)生長(zhǎng)和發(fā)育都極為重要的雄性激素[4]。睪酮合成障礙是引起睪丸損傷以及降低精子質(zhì)量的一個(gè)主要因素。本課題組前期研究[5-6]顯示，鎘暴露會(huì)抑制TM3細(xì)胞睪酮的合成，其抑制作用可能與鎘下調(diào)TM3細(xì)胞睪酮合成路徑中關(guān)鍵酶基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)。但目前對(duì)鎘通過(guò)何種機(jī)制下調(diào)睪酮合成酶的表達(dá)進(jìn)而抑制睪酮合成尚未清楚。

鎘誘導(dǎo)的雄性生殖毒性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[7]。本課題采用TM3細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察鎘處理對(duì)其睪酮的分泌影響以及氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探討氧化應(yīng)激在鎘引起的TM3細(xì)胞損傷中的作用，為闡明氧化應(yīng)激影響男性生殖損傷的機(jī)制和指導(dǎo)男性生殖健康提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)TM3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，加入2.5%胎牛血清(經(jīng)滅活)、5%馬血清(經(jīng)滅活)和1%雙抗溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基，并且在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。

1.2化學(xué)試劑睪酮含量檢測(cè)ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；RT和PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；化學(xué)物發(fā)光增強(qiáng)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)于北京博奧森科技有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他未說(shuō)明生化試劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.3細(xì)胞處理待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長(zhǎng)至瓶底80%～90%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，充分混勻后制成約106/ml的細(xì)胞懸液。接種一定數(shù)目的細(xì)胞于培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶中，分別于特定處理時(shí)間后收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞用于睪酮的含量和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4ELISA法檢測(cè)睪酮含量TM3細(xì)胞經(jīng)20 μmol/L CdCl2處理4 h、8 h后，1 000 r/min離心10 min后收集上清液，用ELISA法檢測(cè)睪酮的含量。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)步驟操作后，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處重復(fù)測(cè)量3次各孔的OD值，并取平均值按照曲線方程計(jì)算各孔細(xì)胞上清液中睪酮的含量。

1.5Westernblot法檢測(cè)血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和血紅素加氧酶-2(hemeoxygenase-2,HO-2)蛋白的表達(dá)鎘處理(4 h、8 h)后收集細(xì)胞，刮下貼壁細(xì)胞后用RIPA裂解液在冰盒上用攪拌器攪拌裂解5 min，冰上靜置裂解20 min左右，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，吸取上清液(盡量不要吸到底部的沉淀)于1.5 ml的離心管，置于冰上。采用BCA試劑盒測(cè)定裂解液中總蛋白濃度，將蛋白樣品用RIPA裂解液稀釋定量至同一濃度。細(xì)胞蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4 ∶1的比例混合后，在蛋白變性儀上100 ℃、10 min進(jìn)行蛋白變性。加熱變性后的細(xì)胞總蛋白樣品置于-20 ℃或-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，采用5% 脫脂牛奶封閉后的PVDF膜分別用一抗[β-actin(1 ∶2 000)、HO-1(1 ∶6 000)及HO-2(1 ∶1 000)] 4 ℃孵育過(guò)夜，之后用抗小鼠或抗兔IgG[β-actin(1 ∶40 000)、HO-1(1 ∶50 000及HO-2(1 ∶40 000)]于搖床上室溫孵育2 h左右。用含0.05% Tween-20的DPBS洗滌3次(10 min/次)，最后再用DPBS洗滌1次(5 min)，之后用Tanon顯影儀器(化學(xué)發(fā)光)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果分析：用內(nèi)參β-actin將目的蛋白的表達(dá)水平標(biāo)化，將對(duì)照組標(biāo)化后的比值定為1。

1.6RT-PCR法檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA的表達(dá)用20 μmol/L鎘處理TM3細(xì)胞4 h、8 h后收集細(xì)胞提取RNA后吸取一定體積的RNA樣品。隨后用AMV法對(duì)細(xì)胞樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA[SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)]的引物與樣品RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。使用LightCycler 480 PCR儀，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后按95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s的程序進(jìn)行45次循環(huán)反應(yīng)。以18S作為內(nèi)參，使用LightCycler 480 PCR儀統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所有的實(shí)時(shí)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析(One-way ANOVA) 進(jìn)行組間差異的檢驗(yàn)，兩組間比較用Q檢驗(yàn)(Students-Newman-Keuls，SNK) ，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CdCl2處理對(duì)TM3細(xì)胞睪酮分泌的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CdCl2處理TM3細(xì)胞4 h和8 h后上清液中的睪酮含量明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=140.8,P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 CdCl2對(duì)TM3細(xì)胞睪酮分泌的影響與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.2CdCl2處理對(duì)TM3細(xì)胞抗氧化酶體系mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，CdCl2處理組SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px和CAT mRNA的表達(dá)水平均呈下降的趨勢(shì)，其中CdCl2處理8 h組SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px及CAT mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組比較均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.58、18.89、55.24、91.66、30.32，P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3CdCl2處理對(duì)TM3細(xì)胞HO-1mRNA和HO-1、HO-2蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，CdCl2處理TM3細(xì)胞4 h 后HO-1 mRNA的表達(dá)量顯著上升(F=545.20,P<0.01)， TM3細(xì)胞HO-1 mRNA的表達(dá)在CdCl2處理8 h組中進(jìn)一步增高(圖3A) (F=545.20,P<0.01)；HO-1蛋白在CdCl2處理的TM3細(xì)胞中被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，并且隨著CdCl2處理時(shí)間的增加，這種誘導(dǎo)的作用更加明顯(圖3B) (F=588.70,P<0.01)；TM3細(xì)胞中HO-2蛋白的表達(dá)量與其被CdCl2染毒前后無(wú)明顯相關(guān)(圖3C)。

3 討論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸中的內(nèi)分泌細(xì)胞，其主要功能是合成和分泌睪酮。睪酮對(duì)男性正常生殖功能的維系尤為重要。動(dòng)物體內(nèi)研究[6]結(jié)果表明，鎘能夠損害睪丸發(fā)育，減少精子發(fā)生，其可能與鎘抑制睪酮的合成和分泌有關(guān)。本課題組采用TM3細(xì)胞的體外研究表明，鎘處理組TM3細(xì)胞的睪酮含量明顯低于對(duì)照組，提示其能抑制TM3細(xì)胞中睪酮的分泌和合成。

圖2 CdCl2處理后TM3細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶mRNA的表達(dá)A：SOD1；B：SOD2；C：SOD3；D：GSH-Px；E：CAT；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 CdCl2處理后對(duì)TM3細(xì)胞HO-1和HO-2表達(dá)的影響A：HO-1 mRNA；B：HO-1；C：HO-2；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與4 h組比較：##P<0.01

許多研究已表明，氧化應(yīng)激在鎘引起的雄性生殖毒性中發(fā)揮重要作用。SOD在機(jī)體暴露于氧化應(yīng)激時(shí)可被迅速誘導(dǎo)，能催化超氧化物自由基歧化(或分配)成分子氧和過(guò)氧化氫。CAT是絕大部分需氧生物體中的常見(jiàn)酶，可以將過(guò)氧化氫分解成分子氧和水，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[8]。在大量研究中，當(dāng)生物體遭受環(huán)境化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激時(shí)，SOD和CAT的活性及其基因的轉(zhuǎn)錄會(huì)發(fā)生改變[9]。除SOD和CAT以外，谷胱甘肽(GSH)是動(dòng)物中最重要的硫醇化合物，可以保護(hù)細(xì)胞避免其受氧化損傷[10]。本研究顯示，鎘處理組的TM3細(xì)胞SOD1、 SOD2、 SOD3、 GSH-Px和 CAT mRNA表達(dá)降低。提示鎘抑制TM3細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)，使其發(fā)生氧化應(yīng)激并造成損傷，并可能損害其睪酮合成的功能。

HO-1由HMOX1編碼，是一種能將血紅素降解成一氧化碳(CO)，亞鐵離子(Fe2+)和膽綠素并具有抗凋亡和抗炎的細(xì)胞保護(hù)性酶，參與各種病理生理過(guò)程[11]。許多研究提出，HO系統(tǒng)的活性能提供細(xì)胞保護(hù)來(lái)抵抗氧化應(yīng)激。HO-1為誘導(dǎo)型酶，正常情況下體內(nèi)表達(dá)很低，但在應(yīng)激或炎癥發(fā)生等情況下， HO-1被誘導(dǎo)表達(dá)以維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[12-13]。值得注意的是，HO-1的誘導(dǎo)并不全是對(duì)機(jī)體有益的。有研究[14]表明HO-1的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致體外和體內(nèi)模型中的肌肉損傷，導(dǎo)致骨骼肌萎縮，且HO-1的缺乏明顯減輕了肌肉萎縮。在睪丸組織中，HO-1在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中僅少量表達(dá)，而鎘應(yīng)激誘導(dǎo)TM3細(xì)胞HO-1大量表達(dá)，提示其可能在其致睪丸的生殖毒性中發(fā)揮作用。在MA-10 Leydig腫瘤細(xì)胞中，HO同工酶降低了類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白水平，并且氯化血紅素處理抑制了膽固醇向孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化[15]。本研究結(jié)果表明，HO-1在鎘誘導(dǎo)的 TM3細(xì)胞中明顯表達(dá)并可能參與了睪酮分泌的抑制過(guò)程。