楊 丹， 田新會， 杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心， 甘肅 蘭州， 730070)

植物的抗寒性是指對低溫做出應(yīng)激反應(yīng)的一種生理特性，受遺傳和環(huán)境的綜合影響。在低溫條件下，植物生理生化和組織刺激的反應(yīng)機(jī)制包括對外界刺激的感受、信號的放大、傳輸及應(yīng)答，從而引起相應(yīng)的生理指標(biāo)變化[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在植物抗寒性生理特性方面研究較多，而且聚焦于培育和選擇抗寒性強(qiáng)的作物來提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[2]。

隨著外界環(huán)境溫度的變化，植物體內(nèi)的代謝和生理活動都會隨之發(fā)生改變，而這些生理代謝活動都是在水的參與下進(jìn)行的。因此，植物在低溫條件下的水分變化情況，可作為檢驗植物抗寒性的重要內(nèi)容之一[3]。葉綠素含量(Chlorophyll，CHL)在低溫脅迫下的變化情況，在一定程度上反映植物光合作用的變化規(guī)律，即植物對低溫脅迫的敏感性[4]?？扇苄蕴?Soluble Sugar，SS)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，在植物抗寒性研究中一直被廣泛關(guān)注，可溶性糖含量越高植物的抗寒性越強(qiáng)，反之則越弱。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)作為細(xì)胞質(zhì)膜過氧化的主要產(chǎn)物，在低溫條件下，抗寒性強(qiáng)的品種丙二醛含量低于抗寒性弱的品種[5]。葉片超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)被稱為植物體內(nèi)消除氧自由基的保護(hù)酶系統(tǒng)，可作為抗寒性評價關(guān)鍵指標(biāo)。這3者在機(jī)體抵御脅迫損傷時相輔相成，共同發(fā)揮著保護(hù)作用，使植株免受或少受活性氧傷害[6]。

紅三葉(Trifoliumpratense)又稱紅車軸草、紅荷蘭翹搖等，其營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，含有家畜所需的多種氨基酸及維生素，草質(zhì)柔軟，適口性好，家畜喜食。紅三葉適宜在溫暖濕潤的環(huán)境下生長，超過最適氣溫(15～25℃)都會使其生長受到影響[7]，并直接影響其越冬性和翌年生物產(chǎn)量。崔英[8]和王曉軍[9]把幾項生理生化指標(biāo)結(jié)合起來，對不同紅三葉品種的抗寒性進(jìn)行了研究，鑒定了不同紅三葉品種抗寒性強(qiáng)弱。目前，國內(nèi)對紅三葉耐低溫性方面的研究較少?？琢罨踇7]以4℃低溫脅迫12 h為周期，對4個紅三葉材料的生理指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，處理的時間越長，葉片含水量和葉綠素含量下降的程度也越大，但是相對膜透性、MDA含量及SOD，POD和CAT酶活性隨著低溫處理時間的延長而升高。本研究擬通過人工模擬4℃低溫環(huán)境，在孔令慧研究的基礎(chǔ)上，將低溫脅迫時間延長至21 d，以研究甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)利用澳大利亞紅三葉品種Sensation和Renegade有性雜交培育紅三葉新品系的耐低溫性，旨在為紅三葉新品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)利用澳大利亞紅三葉品種Sensation和Renegade有性雜交，經(jīng)無性繁殖得到的紅三葉新品系(R)，對照品種岷山紅三葉(CK1)和甘紅1號紅三葉(CK2)為國家審定登記的適宜于甘肅省種植的紅三葉品種。

1.2 試驗方法與設(shè)計

試驗于2017年4月7日在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)伏羲堂進(jìn)行。取新鮮土壤與砂土按1:1比例進(jìn)行均勻混合，裝入直徑22 cm，深15 cm的花盆中，分別選取籽粒飽滿的紅三葉新品系、甘紅紅三葉和岷山紅三葉種子各40粒種入花盆中，每個花盆種10粒，每個材料重復(fù)4次，放入光照培養(yǎng)箱(溫度20℃，光照20 h)，定期澆水，待紅三葉材料長出第5片葉片后，從每個花盆中隨機(jī)取5片新鮮葉片以備測定生理生化指標(biāo)，作為第0 d數(shù)據(jù)。調(diào)節(jié)光照培養(yǎng)箱溫度為4℃，進(jìn)行耐低溫性試驗[7]，分別于第7 d，14 d和21 d隨機(jī)選取3～5 g的新鮮葉片[10]，測定相應(yīng)的生理生化指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

葉片含水量采用烘干法測定，葉綠素含量采用丙酮反復(fù)提取法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，葉片超氧化物歧化酶用氮藍(lán)四唑法測定，過氧化物酶采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶采用紫外吸收法測定。以上各指標(biāo)的測定參考植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[11]和植物生理學(xué)實驗分析測定技術(shù)[12]進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用EXCEL2010對參試紅三葉材料間，低溫脅迫天數(shù)間及紅三葉材料與低溫脅迫天數(shù)交互作用間的數(shù)據(jù)求平均值并進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和做圖，利用SPSS19.0進(jìn)行方差分析，有顯著或極顯著差異時用DUNCAN法進(jìn)行多重比較。

1.5 綜合評價

(1)用以下公式對各紅三葉材料各性狀的具體函數(shù)值進(jìn)行計算：

(1)

(2)

上式中，Uij為i材料的j性狀的隸屬函數(shù)值，Xij為i材料的j性狀值，Xjmin為各紅三葉材料j性狀的最小值，Xjmax為各紅三葉材料j性狀的最大值。當(dāng)j性狀與植物的耐低溫性成正相關(guān)時，用(1)式；當(dāng)j性狀與植物耐低溫性成負(fù)相關(guān)時用(2)式。

(2)把每個紅三葉材料各個性狀的具體耐低溫隸屬值進(jìn)行累加，并求出平均值:

(3)

上式中，Ui為i材料的耐低溫隸屬函數(shù)平均值，Ui越大，耐低溫性越強(qiáng)；反之越小[13]。

2 結(jié)果與分析

F測驗(表1)表明，供試紅三葉材料間，除LWC無顯著性差異外，MDA含量和CAT活性的差異顯著(P<0.05)，CHL、SS含量及POD和SOD活性的差異極顯著(P<0.01)；低溫脅迫天數(shù)間，除CHL含量和MDA含量的差異顯著外(P<0.05)，其他測定指標(biāo)的差異極顯著(P<0.01)；紅三葉材料與低溫脅迫天數(shù)交互作用間，SS含量及CAT和POD活性的差異顯著(P<0.05)，LWC、CHL含量、MDA含量及SOD活性的差異極顯著(P<0.01)。需對上述存在顯著或極顯著的指標(biāo)進(jìn)行多重比較。

表1 紅三葉材料間、低溫脅迫天數(shù)間及紅三葉材料低溫脅迫天數(shù)交互作用間葉片含水量、葉綠素、 可溶性糖、MDA、POD、SOD、CAT的方差分析Table 1 Analysis of variance of content of leaf water,chlorophyll,soluble sugar,MDA,POD,SOD and CAT in red clover leaf

注：*表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；**表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。下同

Note:*indicated significant difference at the 0.05 level;** indicated significant difference at the 0.01 level. The same as below

2.1 紅三葉材料間生理生化指標(biāo)的差異

如表2所示，3份紅三葉材料中R的葉綠素含量最高，其次為CK1，CK2的葉綠素含量最低，且3者均存在顯著性差異(P<0.05)；可溶性糖含量顯著低于CK1和CK2；MDA含量最高，與2對照材料有顯著差異(P<0.05)，CK2的MDA含量最低，CK1居中；SOD活性顯著高于CK1和CK2(P<0.05)，CK1的SOD活性略低于CK2，但無顯著差異；POD活性最高，其次為CK1，CK2最低，3者間均存在顯著性差異(P<0.05)；CAT活性顯著高于CK1和CK2(P<0.05)，CK1的CAT活性略高于CK2，且2者間無顯著差異。

2.2 低溫脅迫天數(shù)間紅三葉材料生理生化指標(biāo)的變化

由表2可知，供試紅三葉材料的葉片含水量和葉綠素含量，隨著脅迫天數(shù)的增加而逐漸降低，且脅迫處理后均顯著低于第0 d(P<0.05)，脅迫第21 d時達(dá)到最小值，與其他各處理天數(shù)間存在顯著性差異(P<0.05)；不同脅迫天數(shù)間，供試紅三葉材料的可溶性糖含量和MDA含量均存在顯著性差異(P<0.05)，且總體變化趨勢一致，即隨著脅迫天數(shù)的增加，2者均不斷上升，脅迫第21 d時達(dá)到最大值，且顯著高于其他處理(P<0.05)；葉片SOD，POD和CAT活性，隨著低溫脅迫天數(shù)的增加，呈先升高后下降的變化趨勢，且均在脅迫第14 d時達(dá)到最大值。

2.3 紅三葉材料×低溫脅迫天數(shù)交互作用間生理生化指標(biāo)的差異

LWC：各處理間供試紅三葉材料的葉片含水量顯著性如圖1(a)所示。正常處理下R的葉片含水量最高，且與CK2存在顯著性差異(P<0.05)；隨著低溫脅迫時間的增加，3種紅三葉材料的葉片含水量變化程度均不相同，除第14 d紅三葉新品系R的葉片含水量顯著低于CK1和CK2外(P<0.05)，其他處理中，R與CK2間均無顯著差異，但顯著低于CK1(P<0.05)。

CHL含量：由圖1(b)可知，對照處理下，R的葉綠素含量顯著高于CK1和CK2(P<0.05)；隨著低溫脅迫時間的延長，紅三葉材料的葉綠素含量呈下降趨勢，第7 d和21 d時R的葉綠素含量顯著高于2對照，14 d時顯著低于CK1，但顯著高于CK2(P<0.05)

表2 紅三葉材料間、低溫脅迫天數(shù)間的生理生化指標(biāo)的差異Table 2 The difference between the number of physiological and biochemical indexes of red clover materials, low temperature stress

注：同一指標(biāo)同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note:Different letters within the same row for the sameparameter mean significant difference at the 0.05 level

圖1 紅三葉材料×低溫脅迫天數(shù)交互作用間葉片含水量和葉綠素含量的差異Fig.1 Differences of leaf water content and chlorophyll content in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days注：不同柱形圖間不同字母表示差異顯著。下同Note:Different letters among different bars mean significant difference at the 0.05 level. The same as below

SS含量：各處理間供試紅三葉材料的差異如圖2(c)所示。在正常條件下，R的可溶性糖含量顯著低于CK2(P<0.05)，但與CK1無顯著性差異；隨著低溫脅迫時間延長，7 d時R的可溶性糖含量顯著低于CK1和CK2(P<0.05)，14 d時其可溶性糖含量顯著高于CK1和CK2(P<0.05)；21 d時R的可溶性糖含量顯著低于CK1(P<0.05)，與CK2無顯著性差異。

MDA含量：由圖2(d)可知，在常溫(0 d)和低溫脅迫7 d時，R的MDA含量均顯著高于2對照材料；14 d時，R的MDA含量顯著低于CK1，但顯著高于CK2(P<0.05)；21 d時，R的MDA含量與CK1無顯著差異，但顯著高于CK2(P<0.05)。

SOD活性：對照處理下，R的SOD活性最低，但與2對照材料不存在顯著性差異；低溫脅迫7～21 d時，R的SOD活性均高于CK1和CK2；7 d時與CK2無顯著差異，但顯著高于CK1；14 d時與2對照均無顯著差異；21 d時顯著高于2對照(P<0.05)(圖3)

POD活性：無論是常溫還是低溫脅迫，R的POD活性最高，且顯著高于2對照材料(P<0.05)，CK2的POD活性最低，CK1居中。(圖3)

CAT活性：各處理間供試紅三葉材料的顯著性如圖3(g)所示。無論是常溫還是低溫脅迫處理，R的CAT活性均顯著高于CK1和CK2(P<0.05)。

圖2 紅三葉材料×低溫脅迫天數(shù)交互作用間葉片可溶性糖含量和丙二醛含量的差異Fig.2 Differences of soluble sugar content and malondialdehyde content in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days

圖3 紅三葉材料×低溫脅迫天數(shù)交互作用間葉片SOD，POD和CAT活性的差異Fig.3 Differences of the SOD,POD and CAT activities in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days

2.4 不同紅三葉材料耐低溫性綜合評價

植物在受到逆境脅迫后，受多種因素的影響[8]。僅依據(jù)單項指標(biāo)不能準(zhǔn)確地評價參試紅三葉材料的耐低溫性強(qiáng)弱。故本試驗采用模糊隸屬函數(shù)法對參試紅三葉材料的LWC，CHL，SS，MDA含量及SOD，POD和CAT活性7項指標(biāo)進(jìn)行耐低溫性隸屬函數(shù)值計算(表3)，并通過耐低溫性綜合分析對其進(jìn)行排序。結(jié)果表明，3份供試紅三葉材料的耐低溫性強(qiáng)弱為R > CK1 > CK2。

表3 不同紅三葉材料的抗寒隸屬函數(shù)值及耐低溫性排序Table 3 Subordinate function values of low temperature resistance and order for different red clover materials

3 討論

抗寒性鑒定是牧草種質(zhì)資源評價的重要內(nèi)容之一。植物的抗寒性由其遺傳特性決定的，是植物長期處于低溫寒冷環(huán)境的過程中，通過本身的遺傳變異和自然選擇獲得的一種抗寒能力。不同植物抗寒性不同，甚至同一植物不同器官的抗寒性也不一樣[14]?？购詮?qiáng)的植物其LWC含量較低，CHL含量下降的幅度較小，有利于植物對低溫環(huán)境的適應(yīng)性[15]?？购詮?qiáng)的苜蓿品種在低溫條件下能夠維持較高的SOD，POD和CAT活性[16]。劉瑞媛[17]研究表明，不同甜高粱均具有一定的抗寒性但其抗寒能力有一定差異。本試驗結(jié)果表明，紅三葉新品系的LWC最低，CHL含量及葉片SOD，POD和CAT活性最高，CK1的LWC最高，CK2的SS含量最高，說明在低溫脅迫條件下不同紅三葉材料的各項生理指標(biāo)表現(xiàn)不一致(表2)，用單一指標(biāo)難以衡量其耐低溫性強(qiáng)弱。

本研究得出，低溫脅迫21 d時供試紅三葉材料的LWC顯著低于脅迫前，說明植物的耐低溫性和植物的LWC之間存在著緊密聯(lián)系。溫度是制約酶活性高低的重要因子之一，當(dāng)?shù)蜏孛{迫超過植物體所能承受的能力時光合作用就會受到不可逆?zhèn)?，光合作用色素含量也會明顯減少[18]，本研究得出，隨著低溫脅迫程度的加劇，參試紅三葉材料的CHL含量顯著降低，這與王寧[19]的研究結(jié)果一致，說明低溫脅迫不但讓植物體葉片葉綠素合成受阻，還會造成葉片葉綠素降解速度的升高，最終使植物葉片CHL含量下降。申曉慧[20]研究得出，抗寒性強(qiáng)的苜蓿材料在冬季最冷月時，SS含量高于其他品種。趙一鶴等[21]研究表明，隨著低溫脅迫時間的延長，3個甜角品種幼苗葉片的LWC呈下降趨勢，MDA含量，Pro含量和SS含量呈上升趨勢。老麥芒和巴旦杏受到低溫脅迫SS含量上升，細(xì)胞膜受損傷程度加深[22-23]。本研究得出，隨脅迫時間的延長，供試紅三葉材料的MDA含量和SS含量均呈上升趨勢，說明受低溫脅迫影響，中間產(chǎn)物自由基和MDA，與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生強(qiáng)烈地反應(yīng)，因而引起對酶和膜的嚴(yán)重傷害，導(dǎo)致膜的結(jié)構(gòu)、生理完整性及許多生物功能分子的破壞；而SS不但可以提高細(xì)胞的滲透濃度，降低水勢，增加植株的持水能力，同時還可以作為冰的保護(hù)劑對原生質(zhì)體和線粒體起保護(hù)作用，對提高植物的耐低溫性具有重要作用[24]，這也與前人[21-23]研究結(jié)果相符合。

SOD和POD共同作用，將有毒的自由基活性氧還原成水和氧分子，CAT對線粒體和膜脂過氧化產(chǎn)生的活性氧有清除作用。這 3種保護(hù)性酶與植物抗寒性密切相關(guān)，已被研究所證明[6]。本試驗結(jié)果表明，隨著低溫脅迫時間的延長，紅三葉葉片的SOD，POD和CAT活性均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。是因為細(xì)胞中的保護(hù)酶系統(tǒng)SOD，POD和CAT通過酶活性的增強(qiáng)，來清除體內(nèi)有害物質(zhì)，使細(xì)胞免于傷害或抗性加強(qiáng)[22]。這說明適度低溫脅迫對紅三葉具有抗寒鍛煉的效果，但長期重度低溫脅迫則會使植物酶失活，活性降低。

從紅三葉材料與低溫脅迫天數(shù)間的交互作用而言，隨著低溫脅迫時間的延長，供試紅三葉材料的LWC呈下降趨勢，并在脅迫21 d時達(dá)到最小值。但各材料的變化幅度不同，紅三葉新品系的LWC降幅較大，表明在低溫條件下該品系通過降低體內(nèi)組織含水量，減少了低溫結(jié)冰帶來的傷害[25]。陳代慧等[24]發(fā)現(xiàn)，脅迫天數(shù)相同時，抗寒性強(qiáng)的山茶花品種CHL含量下降程度要小于抗寒性弱的品種。劉雨詩[26]也認(rèn)為抗寒性強(qiáng)的紫花苜蓿擁有更高的CHL含量。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是常溫還是低溫脅迫，紅三葉新品系R的CHL含量均顯著高于CK2，說明紅三葉新品系的耐低溫性較強(qiáng)，這與劉雨詩[26]的研究結(jié)果一致。根據(jù)參試紅三葉材料在低溫脅迫第14 d的MDA和SS含量的變化，紅三葉新品系的MDA含量顯著低于2對照材料，而SS含量顯著高于2對照材料，隨著脅迫時間的延長至21 d時，CK1的SS含量最高，CK2的MDA含量最低，表明參試紅三葉材料在不同脅迫天數(shù)下生理指標(biāo)的變化各異。

從整個脅迫天數(shù)來看，3份紅三葉材料葉片的SOD，POD和CAT活性總體呈先升高后下降的變化趨勢，且紅三葉新品系R的3種酶活性均顯著高于2對照材料，說明在短期低溫脅迫下，參試紅三葉材料產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)SOD，POD和CAT活性增大，以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，抵御逆境，以減輕低溫對植物造成的傷害，但隨著低溫脅迫程度的加劇，膜系統(tǒng)受到的傷害越來越嚴(yán)重，致使細(xì)胞內(nèi)的各種代謝出現(xiàn)紊亂，SOD，POD和CAT活性又開始下降，這表明植物抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的抵抗修復(fù)能力有一定閾值[10]。

在紅三葉生長發(fā)育過程中，不同材料的耐低溫機(jī)制可能不同，因此，為了客觀評價3份紅三葉材料的耐低溫性，需從多個指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮，而隸屬函數(shù)分析則能滿足這一需求，故本試驗采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行分析，結(jié)果表明R耐低溫性強(qiáng)于CK1和CK2。

4 結(jié)論

3個參試材料中，新品系R的LWC和SS含量最低，CHL含量，MDA含量及葉片SOD，POD和CAT活性最高。隨著低溫脅迫時間的延長，供試紅三葉材料的LWC和CHL含量逐漸降低，MDA含量和SS含量則逐漸升高，葉片中SOD，POD和CAT活性均呈先升高后下降的變化趨勢。從紅三葉材料×低溫脅迫天數(shù)交互作用而言，R的CHL含量顯著高于CK2，SS含量及葉片SOD，POD和CAT活性均顯著高于2對照材料?；陔`屬函數(shù)法的綜合評價表明，紅三葉新品系R耐低溫性最強(qiáng)，其次為岷山紅三葉，甘紅1號紅三葉的耐低溫性最差。