生長調(diào)節(jié)劑處理的灑金柏扦插不定根解剖學(xué)研究

趙今哲 劉國彬 張鴻翎 曹 均 張玉萍 廖 婷 王 燁 郭麗琴

( 1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093)

灑金柏（Platycladus orientalis）為柏科（Cupressaceae）側(cè)柏屬（Platycladus）植物，屬于側(cè)柏的變種[1]，春夏葉表層淡黃綠色，秋漸變?yōu)榻瘘S色，入冬轉(zhuǎn)褐黃色，具有較高的觀賞價值。適宜孤植或叢植，可廣泛應(yīng)用于園林綠地、道路綠化等方面，是園林綠化針葉樹種的優(yōu)異資源，目前針葉樹種主要繁殖方式有種子繁殖、嫁接和扦插。其中種子繁殖后代遺傳變異大，優(yōu)良性狀不易保持；嫁接繁殖愈合周期長，繁殖量小；扦插繁殖生產(chǎn)量大、成本低，是無性系培育的主要方法。20世紀(jì)80年代末，全國側(cè)柏協(xié)作組開始側(cè)柏種源調(diào)查及扦插繁殖研究，發(fā)現(xiàn)側(cè)柏扦插以春季（5—6月）和秋季（11月）為佳，高濃度粉劑生根促進(jìn)劑速蘸比低濃度溶劑浸泡24 h效果好[2]。魏黔春[3]發(fā)現(xiàn)可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)變化與插穗生根所需要的能力呈消長關(guān)系；內(nèi)源激素含量變化與側(cè)柏插穗生根關(guān)系密切，吲哚乙酸/脫落酸（IAA/ABA）比值越大，吲哚乙酸/玉米素核苷（IAA/ZR）比值越小，越利于插穗生根。作為側(cè)柏的變種，灑金柏研究相對落后，關(guān)于灑金柏扦插生根過程中插穗內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)變化情況未見研究。本研究在課題組針葉植物扦插繁殖技術(shù)體系建立的基礎(chǔ)上，從解剖學(xué)角度對灑金柏1年生半木質(zhì)化插穗不定根發(fā)育過程中的外部形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，為揭示灑金柏不定根發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制提供形態(tài)解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗地點

試驗所用灑金柏半木質(zhì)化插穗來自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院針葉植物資源圃，品種為優(yōu)1031，16年生。扦插試驗和解剖學(xué)實驗分別在北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院針葉植物繁育智能溫室和林木資源育種實驗室進(jìn)行，扦插試驗于2017年7月進(jìn)行。

1.2 插穗采集與處理

取健康的1年生半木質(zhì)枝條，剪成長約15 cm的插穗，頂部3～4組葉片，現(xiàn)采現(xiàn)插。使用m（IBA）∶m（NAA）=1∶1的溶液處理插穗，低濃度（40、60、80 mg/L）浸泡4 h，高濃度（200、600、1000 mg/L）速沾10 s，扦插于沙床。以清水浸泡為CK，共設(shè)7個處理，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)30根插穗。LK-400自動噴霧設(shè)施（北京林科林業(yè)技術(shù)公司，中國）控制溫濕度。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣方法

灑金柏扦插生根周期長約90 d。取扦插試驗中生根率最高的80 mg/L （m（IBA）∶m（NAA）=1∶1）溶液浸泡4 h處理的插穗，前20 d每10 d取樣1次，20 d后每5 d取樣1次，直至不定根形成，共取樣23次。每次隨機(jī)取5～8株插穗。

1.3.2 形態(tài)觀察

以灑金柏半木質(zhì)化插穗扦插生根過程中插穗基部外部形態(tài)為觀察對象，記錄愈傷組織與根系的生長發(fā)育狀況，CANNON DS126171（佳能株式會社，日本）相機(jī)拍照。

1.3.3 組織結(jié)構(gòu)觀察

以灑金柏半木質(zhì)化插穗扦插生根過程中插穗內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)為觀察對象。將插穗基部1 cm左右剪下，迅速置于FAA固定液，使用石蠟切片法[4-5]制片。灑金柏木質(zhì)部較硬將制片方法優(yōu)化（20%鹽酸軟化10～24 h，不使用粘粘劑，38℃烘片9～10 h可節(jié)約制片時間提高切片質(zhì)量。），使用KD-3358切片機(jī)（上海之信儀器有限公司，中國）切片，厚度為8～12 μm，番紅-固綠染色，在Motic SMZ-168顯微鏡（麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司，中國）下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對灑金柏扦插生根的影響

由表1可知，與CK相比，不同處理能極顯著提高灑金柏扦插生根率（P＜0.01），可將生根率提高19.00%～70.27%。其中80 mg/L浸泡4 h處理的插穗生根率為91.38%，極顯著高于其他處理（P＜0.01），1000 mg/L速沾10 s處理次之，生根率為80.00%顯著高于其他處理（P＜0.05）。不同處理對生根量的影響雖不顯著，但均高于CK。各處理的平均根長均大于CK，其中600 mg/L速沾10 s處理的插穗平均根長為6.55 cm，顯著高于其他處理（P＜0.05）。此外還發(fā)現(xiàn)，無論浸泡處理或速沾處理，生根率均隨濃度增加而升高。

表1 不同處理對灑金柏扦插生根的影響Table 1 Effects of different treatments on rooting of P. orientalis

2.2 灑金柏扦插生根過程的外部形態(tài)觀察

從扦插到形成不定根需要約90 d。由圖1a可知，灑金柏1年生半木質(zhì)化插穗表皮黃褐色，韌皮部呈綠色，厚度占木質(zhì)部的1/2左右。扦插后20 d后，插穗表皮顏色變深，基部出現(xiàn)乳白色愈傷組織。愈傷組織首先出現(xiàn)在基部邊緣，漸漸向周圍分化，最終將切口全部包住。愈傷組織在形成過程中出現(xiàn)不同的形態(tài)變化，新形成的愈傷組織呈乳白色瘤狀突起，有發(fā)育為不定根的可能；部分愈傷組織出現(xiàn)老化形態(tài)逐漸變?yōu)樽睾稚汕馉睿▓D1b、圖1c）。80 d后，發(fā)現(xiàn)少量乳白色不定根伸出（圖1d）。扦插后120 d部分插穗長出1～3條不定根（圖1e），部分插穗形成完整的根系（圖1f），部分插穗基部有老化愈傷組織未見不定根（圖1g、圖1h）。

圖1 灑金柏扦插生根過程形態(tài)觀察Fig. 1 Morphological features of rooting process of P. orientalis cutting

2.3 灑金柏扦插生根過程中組織結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 扦插前插穗的組織結(jié)構(gòu)

由圖2a1可知，灑金柏插穗基部的橫切面由表皮、皮層、維管柱3個部分組成。最外層的表皮細(xì)胞為近似圓形，外側(cè)的細(xì)胞壁上有角質(zhì)層。表皮以內(nèi)是皮層，皮層細(xì)胞大小、形狀不一，分布較疏松，皮層內(nèi)有分泌道，沒有連續(xù)的厚壁組織。皮層以內(nèi)是維管束為木質(zhì)部的基本結(jié)構(gòu)。橫切面中心為髓，是一團(tuán)排列疏松的薄壁細(xì)胞。木質(zhì)部可見連接髓與皮層的髓射線。通過大量連續(xù)切片觀察，在插穗內(nèi)未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基。

2.3.2 不定根原基的起源

插穗基部髓射線向韌皮部方向加寬成多列細(xì)胞（圖2a2），并在髓射線與形成層交匯處形成一團(tuán)細(xì)胞核較大、排列緊密的薄壁細(xì)胞團(tuán)（圖2a3）。該細(xì)胞團(tuán)向皮層方向不斷分化，發(fā)育形成根原始細(xì)胞，其周圍的韌皮細(xì)胞也參與了分化（圖2a4），根原始細(xì)胞經(jīng)過不斷分裂分化，最終形成不定根原基（圖2a5）。此時，不定根內(nèi)部的維管系統(tǒng)也開始形成。不定根原基隨后不斷向前分裂擠破皮層伸出形成不定根，不定根的維管系統(tǒng)與插穗維管形成層相連（圖2a6）。

圖2 灑金柏扦插不定根發(fā)生過程Fig. 2 Adventitious root process of P. orientalis cutting

大多數(shù)插穗扦插后，韌皮部的薄壁細(xì)胞體積變大（圖2a2），之后插穗切口處開始形成愈傷組織。愈傷組織形成后，呈橫向和徑向分裂，并逐漸包圍插穗基部（圖2b2）。觀察發(fā)現(xiàn)，束中形成層相接的髓射線細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，轉(zhuǎn)變?yōu)槭g形成層，其中的薄壁細(xì)胞不斷分裂，將一部分外圍的維管組織向外推擠，這些薄壁細(xì)胞連同皮層的薄壁細(xì)胞共同分裂產(chǎn)生了愈傷組織（圖2a3、圖2b1）。愈傷組織內(nèi)的薄壁細(xì)胞不斷分裂，分化形成不同的組織：一部分分化形成了輸導(dǎo)組織（圖2b2）（愈傷組織內(nèi)的輸導(dǎo)組織部分是插穗基部維管組織的延續(xù)，圖2b3），一部分分化形成了近圓形（鳥巢狀）的結(jié)節(jié)逐漸轉(zhuǎn)化為木質(zhì)部。在木質(zhì)部周圍有細(xì)胞核明顯且排列緊湊的的根原始細(xì)胞（圖2b4），這些細(xì)胞群的體積不斷擴(kuò)大并伸長，逐漸生長成一端較尖的根原基（圖2b5）。根原基繼續(xù)向外增殖、伸長，突破愈傷組織表皮形成不定根，不定根的維管系統(tǒng)形成（圖2b6）。

2.3.3 不定根的發(fā)生過程

根據(jù)形態(tài)解剖學(xué)觀察，灑金柏扦插不定根的形成經(jīng)歷了4個連續(xù)時期，分別為愈傷組織形成期、不定根誘導(dǎo)期、不定根表達(dá)期和不定根伸長期。扦插后0～20 d為愈傷組織形成期，愈傷組織開始發(fā)育并逐漸將插穗基部包?。▓D1a）；扦插后21～40 d為誘導(dǎo)期，插穗切口處的髓射線與形成層相交處以及愈傷組織內(nèi)的輸導(dǎo)組織附近的薄壁細(xì)胞分化成根原始細(xì)胞（圖2a4、圖2b4）；扦插后41～70 d為表達(dá)期，該階段根原始細(xì)胞開始分化形成根原基，根原基不斷伸長并發(fā)育出根的基本結(jié)構(gòu)（圖2a5、圖2b5）；扦插后71～90 d為伸長期，不定根突破皮層或愈傷組織表層，形成肉眼可見的不定根（圖2a6、圖2b6）。扦插后120 d插穗根系基本完成（圖1d）。

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，選擇最優(yōu)的外源激素種類、濃度、處理時間等因素組合可以有效的提高植物扦插的生根率、生根條數(shù)等[6-7]。IBA、NAA處理可提高插穗內(nèi)多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性，促進(jìn)插穗內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的重新分配和內(nèi)源激素的表達(dá)從而促進(jìn)插穗生根，IBA促進(jìn)效果略優(yōu)于NAA[8-10]。本研究中經(jīng)80 mg/L的m（IBA）∶m（NAA）=1∶1處理的插穗生根率最佳為91.38%，比CK提高了3倍。此外，適宜的育苗基質(zhì)可提高插穗的生根率及移栽成活率[11]，灑金柏扦插育苗外源激素種類、濃度、處理時間、育苗基質(zhì)等最優(yōu)組合有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

一般將植物不定根發(fā)育的過程劃分為3個時期，即誘導(dǎo)期、啟動期和表達(dá)期[12-13]，根據(jù)不定根原基形成時間分為潛伏根原基和誘生根原基[14-15]。本研究根據(jù)灑金柏插穗外部形態(tài)及其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)變化，將灑金柏扦插不定根發(fā)生發(fā)育過程劃分為4個連續(xù)時期，即愈傷形成期（持續(xù)20 d左右）、不定根誘導(dǎo)期（持續(xù)20 d左右）、不定根表達(dá)期（持續(xù)30 d左右）、不定根伸長期（持續(xù)20 d左右），因在扦插前灑金柏插穗內(nèi)未觀察到潛伏根源基，所以灑金柏扦插不定根原基屬于誘生根原基。

根據(jù)插穗不定根的發(fā)生部位可將插穗的生根類型分為皮部生根型、愈傷生根型和混合生根型。其中皮部生根型的根原始細(xì)胞通常產(chǎn)生于髓射線、形成層以及兩者相交處，愈傷生根型的根原始細(xì)胞產(chǎn)生于愈傷組織內(nèi)，混合型生根型則具備以上2種類型的特點[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，灑金柏插穗不定根原基起源于髓射線與形成層交叉處、愈傷組織2個位點，由愈傷組織伸出形成不定根，僅個別插穗不定根由皮層伸出。因此，灑金柏生根類型為典型的愈傷生根類型。

植物體受到損傷后，內(nèi)源生長素的合成和移動受到影響，同時激活多個發(fā)育調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而形成愈傷組織[17]。愈傷組織在一定程度上可防止水分散失和細(xì)菌入侵，張鋼民等[18]研究認(rèn)為愈傷組織是不定根形成的前提，但白樺（Betula platyphylla）不定根原基先于愈傷組織形成且愈傷組織內(nèi)未見根原基形成，愈傷組織抑制其不定根形成[19]。在灑金柏扦插生根的過程中，愈傷組織的形成是不定根生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，多數(shù)不定根由愈傷組織形成并伸出體外，但研究同時發(fā)現(xiàn)，過度發(fā)達(dá)的愈傷組織消耗了插穗內(nèi)大量的營養(yǎng)物質(zhì)并不斷分化增殖，形成了惡性循環(huán)，在愈傷組織外層形成褐色硬化表層，進(jìn)而抑制不定根的發(fā)生。植物不定根再生需要經(jīng)過2次“細(xì)胞命運轉(zhuǎn)變”即：形成層細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織細(xì)胞再轉(zhuǎn)變?yōu)楦?xì)胞[20]，這與灑金柏不定根的發(fā)育模式相似。

植物自身的生根能力和遺傳性狀在很大程度上決定了扦插的成活率，插穗生根能力與其木質(zhì)化程度成反比，插穗橫切面結(jié)構(gòu)對不定根發(fā)育有一定影響[21-22]，在桉樹（Eucalyptus robusta）、紅愷木（Alnus rubra）等不定根研究中，認(rèn)為皮層內(nèi)環(huán)狀厚壁組織對不定根發(fā)育有抑制作用[23-24]，王戈戎等[25]通過對喜樹（Camptotheca acuminata）研究認(rèn)為，插穗橫切面內(nèi)不連續(xù)的厚壁組織對不定根發(fā)育沒有影響。本研究通過連續(xù)切片觀察在灑金柏插穗橫切面未發(fā)現(xiàn)厚壁細(xì)胞及環(huán)狀厚壁組織，說明沒有阻礙其不定根發(fā)育的組織結(jié)構(gòu)。通過對比發(fā)現(xiàn)，灑金柏不定根發(fā)育的關(guān)鍵因素為激素等生理生化因素。此外，紅榿木[24]、雜種鵝掌楸（Liriodehdroh chinense）[26]、合歡（Albizia julibrissin）[27]等樹種扦插過程中，部分不定根從插穗皮孔中伸出，此現(xiàn)象未在灑金柏不定根發(fā)育過程中出現(xiàn)，與其生根類型有關(guān)。

通過對灑金柏扦插不定根形成過程中插穗形態(tài)及解剖學(xué)觀察，初步將灑金柏扦插不定根形成劃分為：愈傷形成期、誘導(dǎo)期、表達(dá)期、伸長期。不定根形成是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，組織結(jié)構(gòu)的變化只是其中的一部分，今后結(jié)合其生根過程的激素調(diào)控、基因表達(dá)等方面研究，可將其生根機(jī)理研究更系統(tǒng)深入，建立完整的不定根形成機(jī)制，為灑金柏及其他難生根樹種提高生根效果作參考。