胡英超，王杰，葉夢婷，黨偉，陸洪良

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與恢復(fù)杭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310036

草甘膦是全球范圍內(nèi)普遍使用的一種非選擇性有機(jī)磷除草劑[1]。草甘膦制劑具有良好的水溶性，在田間被大規(guī)模施用。施用的草甘膦制劑大部分被快速降解，但殘余物以及降解代謝產(chǎn)物仍會(huì)滲透到土壤中，或通過地表徑流、田間排水系統(tǒng)等各種途徑進(jìn)入水環(huán)境，對棲息于水環(huán)境中的生物以及居住于污染區(qū)域周邊環(huán)境中的其他動(dòng)物及人體造成潛在危害。之前一些研究認(rèn)為，草甘膦制劑對生態(tài)環(huán)境和生活于其中的生物毒害不大[2]。然而，近年來研究顯示，草甘膦制劑對生物和人體的危害不可忽視[3-4]。當(dāng)水體環(huán)境中草甘膦超一定濃度時(shí)，就可能對包括魚類、兩棲類在內(nèi)的水生動(dòng)物具有潛在毒性，造成幼體生長延遲、性腺發(fā)育畸形以及激素信號傳遞受阻等情況[5-8]。草甘膦對水生動(dòng)物毒性效應(yīng)的研究主要集中于魚類[9-13]。雖然這些研究顯示的結(jié)果并不一致，但已表明草甘膦暴露對魚類的毒害作用是廣泛的[2]。從導(dǎo)致不同程度的DNA損傷的遺傳毒性到改變生理、形態(tài)、行為學(xué)特征或直接致死的毒性效應(yīng)均有報(bào)道[5,9-13]。草甘膦的毒害作用可能不僅僅只發(fā)生在魚類和較低等水生無脊椎動(dòng)物中，對其他高等水生和陸生脊椎動(dòng)物亦可能產(chǎn)生影響。例如一些證據(jù)顯示，慢性低劑量草甘膦暴露與人類肥胖、不孕不育和癌癥等臨床疾病存在潛在關(guān)聯(lián)[14]。

動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力和行為表現(xiàn)被認(rèn)為是與其適合度密切相關(guān)[15]。檢測受環(huán)境污染物脅迫作用下動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)行為反應(yīng)是行為毒理學(xué)的主要內(nèi)容，在一些魚類毒理研究中已得到了廣泛應(yīng)用。阿特拉津、百草枯等農(nóng)藥及其他污染物暴露會(huì)顯著影響斑馬魚(Barchydaniorerio)、日本青鳉(Oryziaslatipes)的運(yùn)動(dòng)行為表現(xiàn)[12,16-20]。例如，斑馬魚在氯化鎘、敵敵畏污染脅迫下行為反應(yīng)過度活躍，而行為強(qiáng)度和活動(dòng)深度下降[19]。爬行動(dòng)物是許多水域及陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，然而涉及此類動(dòng)物(尤其是水生或半水生的龜鱉類)毒理學(xué)方面的研究報(bào)道很少[21-28]。例如，胚胎期多環(huán)芳烴、草甘膦制劑暴露分別影響北美擬鱷龜(Chelydraserpentina)和紅耳滑龜(Trachemysscriptaelegans)的卵孵化成功率和孵出幼體表型[25-26]；水體中氯丹、二氯二苯三氯乙烷和多氯聯(lián)苯等農(nóng)藥殘留可能潛在地改變紅耳滑龜、綠海龜(Cheloniamydas)等龜類的種群性比[22-23,29]。到目前為止，極少見有關(guān)于研究環(huán)境污染物暴露是否影響龜鱉類動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為表現(xiàn)的報(bào)道[30]。本研究用不同濃度的草甘膦銨鹽處理孵化過程中的烏龜(Mauremysreevesii)卵，通過測定孵出幼體的個(gè)體大小、游泳能力和迷宮學(xué)習(xí)表現(xiàn)來評價(jià)草甘膦暴露對龜鱉類動(dòng)物的潛在毒性效應(yīng)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)龜卵采集和草甘膦溶液配制

實(shí)驗(yàn)用152枚烏龜卵于2014年7月中旬采購自海寧市龍頭閣兩棲爬行動(dòng)物研究所。所有龜卵均當(dāng)天收集，選取受精的龜卵后，放入裝有濕潤蛭石的泡沫盒內(nèi)運(yùn)回杭州實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用Mettler-Toledo電子天平(型號：PB303-N，Mettler-Toledo儀器(上海)有限公司)稱重，用點(diǎn)光源確定龜卵胚胎位置，用HB中華牌鉛筆在胚胎位置的卵殼表面畫上記號，并在旁邊編上序號。

實(shí)驗(yàn)用草甘膦銨鹽(C3H11N2O5P)樣品采購自浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司，草甘膦含量為68%。稱取適量固體草甘膦銨鹽加入一定量蒸餾水配制成2 000 mg·L-1的母液，然后在2 000 mg·L-1母液中加入蒸餾水分別稀釋10、100和1 000倍，以配制成200、20和2 mg·L-1的草甘膦銨鹽溶液。

1.2 卵孵化及處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對照組(蒸餾水0 mg·L-1)和4個(gè)不同草甘膦濃度(2、20、200和2 000 mg·L-1)的處理組。將卵隨機(jī)地分配于不同處理組。所有龜卵孵化于水勢約為-220 kPa的濕潤基質(zhì)中(蛭石與水的質(zhì)量比為1∶1)。等量的濕潤蛭石放在不同孵化盒中并鋪平，將龜卵近胚胎的一面朝上半埋于濕潤蛭石，孵化盒上覆有塑料薄膜以防止基質(zhì)水分快速蒸發(fā)。所有含龜卵的孵化盒均放置于溫度為29 ℃(該溫度為烏龜胚胎發(fā)育的最適溫度，使卵孵出1∶1雌雄性比的幼體[31])的人工氣候室內(nèi)。孵化過程中，每隔2 d對孵化盒稱重并及時(shí)補(bǔ)充基質(zhì)水分以保持其濕度恒定。

每日上午8:00—10:00期間，用移液槍吸取100 μL相應(yīng)濃度的暴露溶液均勻地涂抹在胚胎位置上方的卵表面上(對照組則吸取100 μL蒸餾水涂抹于龜卵表面)[28]。卵孵化過程中，每日檢查龜卵狀況，若發(fā)現(xiàn)龜卵表面出現(xiàn)霉菌斑塊或整枚卵霉變而不可孵，則及時(shí)清理霉斑或者移除霉變卵。

1.3 幼體大小、翻身表現(xiàn)及學(xué)習(xí)能力的測定

龜卵孵化后，記錄孵出的時(shí)間。孵化期以卵帶回實(shí)驗(yàn)室至孵出為止的時(shí)間間隔表示，孵化成功率以各處理組成功孵出卵數(shù)占總?cè)敕趼褦?shù)的百分比表示。幼體孵出后，檢查畸形情況，用Mettler-Toledo電子天平測量體質(zhì)量。

待孵出幼體腹部卵黃完全吸收后，測定其翻身表現(xiàn)。幼體翻身表現(xiàn)在溫度設(shè)置為29 ℃的人工氣候室中進(jìn)行。測試開始前，將含有幼體的玻璃飼養(yǎng)缸(不含水)放置于人工氣候室1 h以使其體溫達(dá)到相應(yīng)水平，并適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室測試環(huán)境。待測的幼龜放置于小方盒(20 cm×10 cm×7 cm)中并迅速將其翻轉(zhuǎn)(背部朝下，腹部朝上)。方盒正上方架有垂直向下的Panasonic數(shù)碼攝像機(jī)(型號：HDC-HS900, Panasonic corporation, Osaka, Japan)同時(shí)記錄幼龜?shù)姆磉^程。翻身測試以10 min為限，若幼龜在該限期內(nèi)未能成功翻身，則判定為翻身失敗。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，視頻片段用MGI Video Wave III軟件(MGI Software Co., Canada)讀出，翻身時(shí)間以幼龜翻轉(zhuǎn)至翻身成功的時(shí)間間隔表示。

幼龜翻身表現(xiàn)測試結(jié)束后，單獨(dú)飼養(yǎng)于含水約3 cm高的飼養(yǎng)缸，并放置于29 ℃人工氣候室內(nèi)。每隔3 d換水，待幼龜開食后，每日投喂適量商業(yè)化幼龜飼料。幼龜孵出約1個(gè)月后，測定其學(xué)習(xí)能力。幼龜學(xué)習(xí)能力測定在自制的玻璃十字迷宮中進(jìn)行(圖1)[32]。十字迷宮內(nèi)含高約3 cm的水，放置于29 ℃人工氣候室。學(xué)習(xí)能力測定前，幼龜禁食3 d。禁食結(jié)束后，幼龜移入十字迷宮內(nèi)(A端)自行尋找食物2 d。將單只幼龜放入迷宮的一端，適量飼料放于其呈直角的一端(B端)。幼龜自由覓食，攝食后放回原飼養(yǎng)缸。之后2 d，在相同迷宮臂一端繼續(xù)投放食物，但于投放點(diǎn)前布以網(wǎng)孔的透明隔板使幼龜不能獲取食物。訓(xùn)練結(jié)束后，撤掉投放點(diǎn)隔板，隨機(jī)選取幼龜移至訓(xùn)練時(shí)一致的十字迷宮臂端。迷宮正上方架有垂直向下的Panasonic數(shù)碼攝像機(jī)以記錄整個(gè)測試期間的幼龜活動(dòng)情況，視頻片段自動(dòng)記錄于計(jì)算機(jī)。迷宮實(shí)驗(yàn)限定時(shí)間為20 min，20 min內(nèi)未找到食物則記為失敗。獲得的視頻片段用SMART視頻行為學(xué)分析系統(tǒng)(Vision 2.5, Panlab Inc., Barcelona, Spain)進(jìn)行軌跡分析，記錄幼龜從放入迷宮至找到食物所用的時(shí)間和在迷宮內(nèi)移動(dòng)的總距離。

1.4 數(shù)據(jù)處理

200 mg·L-1處理組因?qū)嶒?yàn)過程中操作失誤(卵被摔碰)使其中20枚卵不可孵，相應(yīng)的數(shù)據(jù)并未用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)用Statistica 6.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析前，用Kolmogorov-Smirnov檢測驗(yàn)證數(shù)據(jù)正態(tài)性；用Bartlett檢驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)方差同質(zhì)性。用以入孵卵質(zhì)量為協(xié)變量的單因子協(xié)方差分析檢測草甘膦銨鹽處理對孵出幼體大小的影響；用似然比檢驗(yàn)(G檢驗(yàn))檢測不同處理下卵孵化成功率的差異；用單因子方差分析檢測草甘膦銨鹽處理對烏龜孵出幼體翻身表現(xiàn)和學(xué)習(xí)能力的影響；用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

圖1 烏龜學(xué)習(xí)行為測量的示意圖Fig. 1 The diagram of the apparatus used for learning behavioral measurement of turtles

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度草甘膦銨鹽處理對烏龜胚胎發(fā)育的影響

不同濃度草甘膦銨鹽處理組下孵入的烏龜卵大小(卵質(zhì)量)無顯著差異(表1)。草甘膦處理對烏龜卵孵化成功率、孵化時(shí)間以及孵出幼體大小均無顯著影響(表1)。在各處理組孵出幼體中也未發(fā)現(xiàn)具明顯畸形的情況。

2.2 不同濃度草甘膦銨鹽處理對烏龜幼體翻身和空間學(xué)習(xí)能力的影響

幼體翻身測試中，僅少數(shù)個(gè)體未在實(shí)驗(yàn)規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成翻身動(dòng)作，相應(yīng)個(gè)體的數(shù)據(jù)未用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。不同濃度草甘膦銨鹽處理對烏龜孵出幼體翻身表現(xiàn)的影響不顯著(F4, 105= 2.11,P= 0.085)(圖2)。迷宮實(shí)驗(yàn)中，未完成覓食行為的相應(yīng)個(gè)體數(shù)據(jù)也未用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。不同濃度草甘膦銨鹽處理下孵出幼龜覓食時(shí)間存在顯著差異(F4, 65= 7.58,P< 0.001)(圖2)，200和2 000 mg·L-1濃度處理組孵出幼體的覓食時(shí)間顯著延長。高濃度的草甘膦銨鹽處理組的孵出幼體在迷宮中移動(dòng)距離比低濃度處理組幼體更短，然而在統(tǒng)計(jì)上移動(dòng)距離的組間差異是邊緣性的(F4, 65= 2.45,P= 0.055)(圖2)。

3 討論(Discussion)

胚胎發(fā)育期是動(dòng)物整個(gè)生活史中最脆弱的階段，胚胎直接暴露于某些環(huán)境污染物可能影響個(gè)體后續(xù)發(fā)育階段的生長與功能表現(xiàn)。本研究用0～2 000 mg·L-1范圍內(nèi)不同濃度的草甘膦銨鹽處理孵化中的烏龜卵，發(fā)現(xiàn)草甘膦銨鹽暴露不影響烏龜胚胎發(fā)育速率、孵出幼體大小，但潛在地影響其覓食表現(xiàn)，從而可能對其后期生長與存活產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。

草甘膦銨鹽暴露對烏龜卵孵化成功率、孵化時(shí)間和孵出幼體大小無顯著的影響。雖然草甘膦暴露對水生生物遺傳、生理和行為等方面的影響廣泛，但總體上仍然認(rèn)為草甘膦制劑的毒性屬于低毒。本研究表明，草甘膦銨鹽暴露未造成發(fā)育中的烏龜胚胎直接死亡也不改變其發(fā)育速率，這一結(jié)果是可以預(yù)見的。相似的結(jié)果也見于其他物種。例如，0～5 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)的草甘膦銨鹽暴露對中華鱉卵孵化成功率、胚胎發(fā)育速率和孵出幼體大小無影響[28]；68～1 501 mg·L-1草甘膦處理對紅耳滑龜卵的孵化成功率和孵出幼體大小影響不大，僅在11 206 mg·L-1濃度處理下孵化成功率較低、孵出幼體較小[26]。相似地，龜鱉類動(dòng)物胚胎期經(jīng)歷另一些農(nóng)藥低濃度暴露，也沒有影響胚胎發(fā)育速率和孵出幼體體型大小。例如，0.004～0.1 mg·L-1的溴氰菊酯暴露并不會(huì)對紅耳滑龜和烏龜孵出幼體大小和孵化時(shí)間產(chǎn)生影響[27]；0.0001～0.1 mg·L-1的阿特拉津暴露也不會(huì)對2種地圖龜(Graptemysouachitensis和G.pseudogeographica)孵出個(gè)體大小和孵化時(shí)間產(chǎn)生影響[30]。

在濃度0～2 000 mg·L-1范圍的草甘膦銨鹽暴露不會(huì)影響烏龜幼體的翻身能力。龜類的翻身能力通常直接或間接地反映個(gè)體健康情況。在某些情況下，它也被認(rèn)為是與龜生存直接相關(guān)的特性[33-34]。那些翻身遲緩的龜類在自然環(huán)境中更容易被捕食，或者受干旱失水等威脅。龜類胚胎發(fā)育時(shí)所經(jīng)歷的環(huán)境(如溫度、濕度等因素)都會(huì)對孵出幼體的翻身能力產(chǎn)生影響[35]。以往大部分研究發(fā)現(xiàn)，胚胎時(shí)期的污染物暴露對幼龜翻身能力(例如紅耳滑龜胚胎在68～11 206 mg·L-1的草甘膦中暴露)的影響較小[26]。僅少數(shù)研究表明，污染物暴露導(dǎo)致龜類翻身能力降低。例如，Meter等[25]發(fā)現(xiàn)無論是暴露于原油還是多環(huán)芳烴都對北美擬鱷龜幼體的翻身能力產(chǎn)生顯著影響。

表1 不同濃度草甘膦銨鹽處理下烏龜入孵卵質(zhì)量、孵化時(shí)間及孵出幼體大小Table 1 Egg mass, incubation length and hatchling body mass of Mauremys reevesii under different concentration treatments of glyphosate-ammonium

圖2 不同濃度草甘膦銨鹽處理組烏龜幼體翻身時(shí)間、覓食時(shí)間及覓食距離注：柱上方的不同字母表示平均值差異顯著，Tukey’s test，a>b。Fig. 2 Righting time, foraging time and movement distance during foraging of Mauremys reevesii hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammoniumNote: Different letters above the vertical bars denote significant differences, Tukey’s test, a>b.

尋找定位重要的環(huán)境資源，如食物、水和遮蔽處，對水生動(dòng)物的生存至關(guān)重要。空間學(xué)習(xí)表現(xiàn)反映了動(dòng)物在搜尋食物時(shí)能否快速準(zhǔn)確地定位并找到食物的能力，亦可反映在逃避捕食者時(shí)能否及時(shí)有效地避開危險(xiǎn)境地的能力[36]。本研究顯示，草甘膦銨鹽暴露潛在地影響烏龜幼體的空間學(xué)習(xí)能力，例如，較高濃度草甘膦銨鹽暴露下孵出幼體的覓食時(shí)間較長，在整個(gè)覓食過程中其移動(dòng)距離似乎也較長。以往的研究發(fā)現(xiàn)，一些污染物暴露也會(huì)影響動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)能力。例如，硫丹、氟氯氰菊酯和新煙堿類等殺蟲劑會(huì)對意大利蜜蜂(Apismellifera)[37]、歐洲熊蜂(Bombusterrestris)[38]的空間學(xué)習(xí)能力造成潛在的影響。此外，重金屬鉛和殺蟲劑毒死蜱暴露對大鼠的空間識(shí)別能力造成影響[39-40]。動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶的能力與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)[41]，污染物暴露可以通過影響膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而對動(dòng)物的學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力產(chǎn)生損傷。例如，草甘膦暴露抑制乙酰膽堿酶等的活性在一些動(dòng)物(包括魚類和蛙類蝌蚪)中已得到證實(shí)[42-43]，但是否與此類動(dòng)物學(xué)習(xí)能力相關(guān)還需進(jìn)一步研究。此外，許多的研究已經(jīng)證實(shí)了草甘膦的神經(jīng)毒性。例如，草甘膦會(huì)引起神經(jīng)元的變性[44]，降低前額皮質(zhì)、中腦和紋狀體中的5-羥色胺和多巴胺水平，從而造成兩者代謝物的累積[45]。同樣的，在人類研究中發(fā)現(xiàn)長期暴露于草甘膦會(huì)容易患上帕金森癥[46]。

盡管本研究顯示，草甘膦銨鹽暴露并沒有給烏龜胚胎發(fā)育以及孵出幼體翻身能力帶來明顯的脅迫效應(yīng)，但幼體的空間學(xué)習(xí)能力可能受到抑制，預(yù)示著更深層次(例如神經(jīng)系統(tǒng))的負(fù)面效應(yīng)。此外，草甘膦銨鹽暴露后幼體覓食時(shí)間延長會(huì)使其在覓食過程中承擔(dān)相對較大的被捕食風(fēng)險(xiǎn)，從而增大其后續(xù)的生存成本。自然環(huán)境中烏龜卵被埋于堤岸邊土壤中孵化。施用過草甘膦制劑的農(nóng)田，經(jīng)數(shù)天時(shí)間降解，其土壤中草甘膦殘留量不高(通常<1.0 mg·L-1)。因此，自然環(huán)境中烏龜胚胎發(fā)育受土壤殘留草甘膦的毒害作用應(yīng)不會(huì)達(dá)到本研究所檢測到的程度。