趙 蕾 鄭美麗 楊 梅 鐘久昌 楊新春

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟中心 北京市高血壓重點實驗室, 北京 100020)

肥胖是一項世界性健康難題，往往導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生。闡明肥胖發(fā)生的分子機制并以此為基礎(chǔ)治療肥胖是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點[1]。小鼠3T3-L1前體脂肪細胞是最常用來研究脂肪細胞的細胞系之一，通過序貫加入一定劑量的誘導(dǎo)劑，即經(jīng)典雞尾酒法，可得到分化成熟的脂肪細胞[2]。然而，傳統(tǒng)雞尾酒法包括的誘導(dǎo)劑，即3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、地塞米松、胰島素，使用后存在誘導(dǎo)效率低、分化效果不理想的問題[3]。因此，本研究旨在優(yōu)化誘導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細胞分化過程，通過比較不同成分誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化成熟脂肪細胞的效率，以期獲得一種高效的前體脂肪細胞誘導(dǎo)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠前體脂肪細胞3T3-L1購自國家實驗細胞資源共享平臺、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細胞中心。高糖DMEM、新生小牛血清(new calf serum, NCS)、0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰酶、Penicillin-Streptomycin (雙抗)(10 000 U/mL)購自美國Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Hyclone公司，IBMX、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、羅格列酮購自德國Sigma公司，油紅O染色液試劑盒購自北京索萊寶公司，三酰甘油測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 誘導(dǎo)分組

細胞按照不同誘導(dǎo)劑A組成成分，分為4組：(1)對照組(經(jīng)典雞尾酒法)：IBMX(0.5 mmol/L)、胰島素(10 mg/L)、地塞米松(1.0 μmol/L)；(2)羅格列酮干預(yù)組：在經(jīng)典雞尾酒成分基礎(chǔ)上，加用羅格列酮(2.5 μmol/L)；(3)吲哚美辛干預(yù)組：在經(jīng)典雞尾酒成分基礎(chǔ)上，加用吲哚美辛(0.2 mmol/L)；(4)羅格列酮和吲哚美辛聯(lián)合干預(yù)組：在經(jīng)典雞尾酒成分基礎(chǔ)上，加用羅格列酮(2.5 μmol/L)和吲哚美辛(0.2 mmol/L)。

1.3 3T3-L1前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化

小鼠3T3-L1前體脂肪細胞在含有10%(體積分數(shù))NCS、100 U/mL Penicillin-Streptomycin的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細胞匯合度達到90%左右，傳代并以5×105密度接種于6孔板中，待細胞生長至完全匯合后，接觸抑制2 d，計為誘導(dǎo)分化0 d，更換新鮮培養(yǎng)基DMEM+10%(體積分數(shù))FBS(2.5 mL/孔)，分組加入誘導(dǎo)劑A，混勻，3 d更換誘導(dǎo)劑B(胰島素10 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM+10%(體積分數(shù))FBS，培養(yǎng)至11 d，得到誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細胞。

1.4 油紅O染色

分別于5、7、9、11 d顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化，于11 d收集細胞并行油紅O染色。采用索萊寶公司油紅O染色液試劑盒，具體操作步驟如下：(1)移除培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入ORO Fixtative固定液固定30 min；(2)棄去固定液，用去離子水洗2次；(3)加入60%(體積分數(shù))異丙醇浸洗5 min；(4)棄去60%(體積分數(shù))異丙醇(1 ml/孔)，加入ORO Stain染液，浸染20 min；(5)棄去染色液，去離子水洗5遍，直到無多余染液，置于顯微鏡下觀察、拍照，并運用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件統(tǒng)計經(jīng)油紅O染色后脂滴直徑、數(shù)量以及脂滴面積。去除油紅O染液，PBS洗3遍，每孔加入600 μL 60%(體積分數(shù))異丙醇，室溫靜置30 min后，將溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，酶標(biāo)儀讀取510 nmA值。

1.5 三酰甘油含量測定

于11 d收集各組細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min，離心10 min，取上清后，參照三酰甘油測定試劑盒說明書，分別在96孔板中加入蒸餾水、校準(zhǔn)品、待測樣品以及工作液后，37 ℃孵育10 min，酶標(biāo)儀讀取510 nmA值，測得細胞分泌的三酰甘油濃度。收集各組細胞，PBS洗2遍，1 000 r/min，離心10 min，留取細胞沉淀，加入細胞裂解液100 μL，冰上裂解細胞30 min，裂解好的液體不離心，直接參照三酰甘油測定試劑盒說明書步驟，酶標(biāo)儀讀取510 nmA值。采用BCA法進行細胞內(nèi)蛋白濃度定量后，根據(jù)公式計算得到細胞內(nèi)三酰甘油濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化后細胞形態(tài)學(xué)變化

3T3-L1前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化前呈梭形，胞質(zhì)均一無脂滴，誘導(dǎo)5 d后，各組細胞從梭形逐漸變成橢圓形，胞質(zhì)飽滿，體積較誘導(dǎo)前增大。誘導(dǎo)7 d，細胞體積繼續(xù)增大，其中羅格列酮干預(yù)組、吲哚美辛干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組的細胞胞質(zhì)中開始出現(xiàn)零散的較明顯的小脂滴，而對照組細胞不僅體積較小，同時未見明顯脂滴形成。誘導(dǎo)9 d，各組細胞胞質(zhì)中脂滴進一步增加，主要分布于細胞核周圍，形成“戒環(huán)”，此時羅格列酮干預(yù)組、吲哚美辛干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組細胞形成的脂滴分布較均勻，且形成的脂滴數(shù)量也明顯較對照組多，與羅格列酮干預(yù)組、吲哚美辛干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組相比，對照組不僅形成脂滴少，而且脂滴也偏小。11 d，各組細胞脂滴進一步增大，多個脂滴融合，形成大脂滴，相比羅格列酮干預(yù)組、吲哚美辛干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組，對照組脂滴少且小(圖1)。

2.2 油紅O染色

油紅O染色鑒定成熟脂肪細胞形成。如圖2所示，羅格列酮干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組細胞形成的脂肪脂滴較對照組和吲哚美辛干預(yù)組多。定量檢測結(jié)果顯示，羅格列酮干預(yù)組酶標(biāo)儀510 nm測得的A值為2.22±0.17，聯(lián)合干預(yù)組1.67±0.04，兩組A值均明顯高于對照組0.75±0.03(P<0.001)。吲哚美辛組測得的A值為0.89±0.02，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 3T3-L1前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化過程中形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphological changes during 3T3-L1 preadipocytes differentiation (100×)Control: normal control; Ros: rosiglitazone; Indo: indometacin; Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin.

圖2 3T3-L1前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞后油紅O鑒定Fig.2 Adipocyte formation determined by oil red stainingControl: normal control; Ros: rosiglitazone; Indo: indometacin; Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin.

采用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計經(jīng)油紅O染色后的脂滴，如表1所示，一個視野下脂滴數(shù)量和脂滴總面積對照組均明顯小于其余3組。單個脂滴具體參數(shù)中，羅格列酮組的平均直徑大于對照組[(7.36±0.21)μmvs(5.60±0.26)μm,P<0.05]，平均面積大于對照組[(54.92±4.49)μmvs(21.97±2.26)μm2,P<0.05]，最大直徑大于對照組[(10.49±0.39)μmvs(7.45±0.43)μm,P<0.01]。聯(lián)合干預(yù)組的脂滴平均直徑大于對照組[(7.86±0.23)μmvs(5.60±0.26)μm,P<0.001]，平均面積大于對照組[(65.31±5.37)μmvs(21.97±2.26)μm2,P<0.01]，最大直徑大于對照組[(10.40±0.34)μmvs(7.45±0.43)μm,P<0.05]。而吲哚美辛組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。羅格列酮組和吲哚美辛組相比，羅格列酮組形成脂滴的最大直徑大于吲哚美辛組，聯(lián)合干預(yù)組形成脂滴的平均直徑和平均面積，均大于吲哚美辛單獨干預(yù)組，而與羅格列酮單獨干預(yù)組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05, 圖3)。

表1 3T3-L1成熟脂肪細胞脂滴參數(shù)Tab.1 Parameters of mature 3T3-L1 adipocyte

圖3 3T3-L1成熟脂肪細胞各組脂滴參數(shù)Fig.3 Parameters of mature 3T3-L1 adipocyte in each group

A: mean diameter of adipocyte;B: mean area of adipocyte;C: maximum diameter of adipocyte;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;Control: normal control;Ros: rosiglitazone;Indo: indometacin;Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin.

2.3 3T3-L1細胞中三酰甘油含量測定

油紅O染色后定量檢測間接反映胞內(nèi)三酰甘油含量，羅格列酮干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組明顯高于其他組(圖4A)。通過試劑盒直接檢測細胞內(nèi)形成的三酰甘油含量，對照組(0.19±0.02)mmol/g，羅格列酮組(0.51±0.11)mmol/g，吲哚美辛組(0.50±0.18)mmol/g，聯(lián)合干預(yù)組(0.77±0.07)mmol/g，其中聯(lián)合干預(yù)組明顯高于對照組(P<0.05)(圖4B)。最后檢測培養(yǎng)基中三酰甘油含量，對照組的三酰甘油含量為(0.08±0.04)mmol/g，羅格列酮組(0.28±0.06)mmol/g，吲哚美辛組(0.30±0.07)mmol/g，聯(lián)合干預(yù)組(1.17±0.65)mmol/g，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.92，P=0.47)。

3 討論

3T3-L1前體脂肪細胞作為一種小鼠胚胎成纖維細胞，具有一定的定向分化潛能。當(dāng)給予一定劑量的誘導(dǎo)劑，激活脂肪細胞分化信號通路，可以在誘導(dǎo)劑作用下促使3T3-L1前體脂肪細胞分化成為成熟脂肪細胞[4-5]，而如何得到數(shù)量較多且分化程度較高的成熟脂肪細胞對于后續(xù)實驗的進行也是至關(guān)重要。本研究在經(jīng)典雞尾酒誘導(dǎo)劑的基礎(chǔ)上，分別加用羅格列酮和/或吲哚美辛，觀察對于3T3-L1前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化的影響，并通過油紅O染色鑒定、三酰甘油含量測定評價各組誘導(dǎo)分化效率。研究[5]顯示，羅格列酮加用后前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化效率明顯提高，而加用吲哚美辛的效果不及羅格列酮。

圖4 誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細胞中三酰甘油含量Fig.4 Triglyceride (TG) contents in mature 3T3-L1 adipocyte

A: absorbance at 510 nm of quantified oil red staining;B: intracellular TG contents determined by enzymatic assay;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;Control: normal control;Ros: rosiglitazone;Indo: indometacin;Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin；TG：triglyceride.

3T3-L1前體脂肪細胞在誘導(dǎo)分化過程中，主要通過調(diào)控一系列誘導(dǎo)分化的轉(zhuǎn)錄因子表達實現(xiàn)成脂過程[6]，其中過氧化物酶體增生因子活化γ型受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR-γ)是關(guān)鍵因子之一[7]。PPAR是調(diào)控目標(biāo)基因表達的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，分為α、β、γ 3種類型，其中PPAR-γ主要調(diào)控脂肪細胞分化和胰島素抵抗[8]。羅格列酮，屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，也是特異性PPAR-γ高效激動劑[9]。

本研究中，在經(jīng)典雞尾酒誘導(dǎo)劑基礎(chǔ)上加用羅格列酮后，3T3-L1前體脂肪細胞更早出現(xiàn)脂滴，形成的脂滴也較對照組多，同時三酰甘油含量也較多，提示羅格列酮通過進一步激活PPAR-γ促進成脂過程。吲哚美辛，屬于非甾體類抗炎藥，已有研究[10]顯示，非甾體類抗炎藥也可以與PPAR-γ結(jié)合并使其活化。本研究中加用吲哚美辛后，前體脂肪細胞也較早形成脂滴，但是脂滴直徑與面積以及三酰甘油濃度與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此，相比羅格列酮，吲哚美辛激動PPAR-γ能力較弱。在三酰甘油生成含量的測定中，雖然油紅O染色間接定量中，加用PPAR-γ激動劑后生成含量增加，但是直接法測定的胞外三酰甘油濃度經(jīng)過蛋白含量校正后，4組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而在同時加用吲哚美辛和羅格列酮的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)過程中，細胞內(nèi)形成的三酰甘油濃度高于對照組，單用以上兩種藥物生成的三酰甘油濃度并沒有任何優(yōu)勢，因此提示可以適量加用兩種及以上藥物共同激動PPAR-γ表達，促進成脂過程，增加胞內(nèi)三酰甘油濃度。如何進一步提高胞外三酰甘油濃度以及藥物濃度是否影響誘導(dǎo)分化過程亟須進一步明確。

本研究初步提示在經(jīng)典雞尾酒誘導(dǎo)劑基礎(chǔ)上適量加用PPAR-γ受體激動劑，可有效提高3T3-L1前體脂肪細胞分化效率，增加三酰甘油濃度，為后續(xù)以脂肪細胞為基礎(chǔ)的實驗提供一個較理想的細胞模型。有關(guān)PPAR-γ受體激動劑的選用，目前推薦噻唑烷二酮類羅格列酮，較非甾體類抗炎藥誘導(dǎo)分化效果更好。