蘇蘭娣 李芹 江秀玲 羅雪 彭建明

揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院（江蘇揚(yáng)州225009）

腸癌是惡性腫瘤中常見的死亡原因之一。根據(jù)美國腫瘤協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)，在2016年美國大約有140萬的腸癌患者，此外還有134 490例新發(fā)的腸癌患者［1］。因此，腸癌已經(jīng)成為急需解決的全球健康問題之一?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腸癌主要由腫瘤干細(xì)胞所起始，腫瘤干細(xì)胞是實(shí)體瘤中一小群的腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞能夠驅(qū)動(dòng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［2-4］。腫瘤干細(xì)胞最初在急性髓細(xì)胞白血病中被發(fā)現(xiàn)，隨后在其他多種類型的腫瘤如乳腺癌、腸癌、肺癌等亦存在腫瘤干細(xì)胞。雖然腫瘤干細(xì)胞在腸癌細(xì)胞中的比例不高，但腫瘤干細(xì)胞卻是促使腸癌惡性進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的罪魁禍?zhǔn)祝?，4］。因此，靶向腸癌干細(xì)胞已成為抗腸癌藥物研發(fā)中的熱點(diǎn)。

雷公藤紅素（Celastrol）是一種五環(huán)三萜類化合物，主要來源于雷公藤、南蛇藤等植物。研究顯示，雷公藤紅素具有抗炎、抗生育、抗菌以及抗腫瘤等多種藥理學(xué)功能［5-6］。然而關(guān)于雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞干性的作用甚少見于報(bào)道。本研究以人腸癌細(xì)胞CCL-244為模型，分析了雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞干性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)人腸癌細(xì)胞CCL-244購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。CCL-244細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以下各實(shí)驗(yàn)部分所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2 主要試劑與儀器雷公藤紅素購自上海詩丹德生物公司，純度＞98%，用二甲基亞砜（DMSO）配置成50 mmol/L備用；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自AMRESO公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒和通用二抗購于北京全式金生物公司；PCR引物購自上海生物工程技術(shù)有限公司；CD133、CD44、pAKT和AKT和GAPDH一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。EPS 300電泳儀購自上海天能科技有限公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo Forma公司，半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)購自美國BIORAD公司。

1.3 MTT法測定細(xì)胞體外生長取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中。加入不同濃度的雷公藤紅素48 h后，利用MTT法測定腫瘤細(xì)胞的活性。每孔加入10 μL MTT混勻后在37℃培養(yǎng)4 h。然后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，利用酶標(biāo)儀測定OD492 nm的吸光度值。抑制率計(jì)算如下：抑制率=（1-OD藥物組/OD對(duì)照組）×100%。

1.4 細(xì)胞克隆形成測定CCL-244細(xì)胞經(jīng)消化后以500/孔接種于6孔板中，第2天分別給藥雷公藤紅素至終濃度分別為0、1、2 μmol/L。以后每隔3～4 d替換培養(yǎng)基一次，培養(yǎng)14 d后終止實(shí)驗(yàn)，使用甲醇進(jìn)行固定，然后進(jìn)行吉姆薩染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)各個(gè)孔克隆的數(shù)量。

1.5 RT?PCR法檢測基因的表達(dá)細(xì)胞經(jīng)雷公藤紅素處理后，用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）。然后以cDNA為模板，采用PCR法測定細(xì)胞內(nèi)CD133、CD44和Oct4基因的表達(dá)情況。內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。引物如下：CD133上游引物為5′-AGGCACTTACGGCACTCTTC-3′，下游引物為 5′-GAAGGACTCGTTGCTGGTGA-3′；CD44 上游引物為 5′-CAGCTCATACCAGCCATCCA-3′，下游引物為 5′-AGGTCCTGCTTTCCTTCGTG-3′；Oct4上游引物為5′-GCAAAGCAGAAACCCTCGTG-3′，下游引物為5′-AGCCTGGGGTACCAAAATGG-3′；GAPDH 上游引物為 5′-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，下游引物為5′-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3′。

1.6 Westernblot法檢測蛋白的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)雷公藤紅素處理后，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行配膠后電泳，然后轉(zhuǎn)膜2 h后用5%牛奶封閉，一抗室溫孵育2 h后，經(jīng)洗滌后用二抗孵育1 h后進(jìn)行曝光并顯影。采用Western blot ImageJ對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSSOne-way ANOVA檢驗(yàn)12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間分析采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素抗腫瘤細(xì)胞增殖利用MTT法測定不同劑量的雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL-244增殖的影響。結(jié)果顯示，雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL-244的生長具有顯著的抑制效果，雷公藤紅素各劑量組與對(duì)照組（只有培養(yǎng)液）相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而且隨藥物劑量的不斷增加，其抑制效果亦更加顯著（表1），提示雷公藤紅素能顯著地抑制腸癌細(xì)胞CCL-244增殖。

表1 雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL-244增殖的影響Tab.1 Effects of celastrol on the proliferation of CCL-244 cells x±s

表1 雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL-244增殖的影響Tab.1 Effects of celastrol on the proliferation of CCL-244 cells x±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別增殖率（%）對(duì)照組100 0.25 μmol/L 93.7±1.5 0.5 μmol/L 79.5±1.1*1 μmol/L 66.8±0.1**2 μmol/L 43.5±0.4**4 μmol/L 14.7±0.0**8 μmol/L 11.0±1.0**

2.2 雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL?244克隆形成的影響用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)雷公藤紅素抗腸癌的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果如表2所示，1和2 μmol/L雷公藤紅素處理腸癌細(xì)胞CCL-244后其克隆形成數(shù)量分別為（166.3±5.5）和（109.7±11.0），與對(duì)照組（215.00±8.9）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明雷公藤紅素能夠明顯地抑制腸癌細(xì)胞CCL-244的克隆形成。

2.3 雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL?244干性相關(guān)基因表達(dá)的作用雷公藤紅素處理48 h后，RT-PCR法測定干性相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組比較，雷公藤紅素組細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞干性相關(guān)的基因 CD133（P＜ 0.01）、CD44（P＜ 0.01）和Oct4（P＜0.01）mRNA水平顯著下降。

表2 雷公藤紅素處理后對(duì)CCL-244細(xì)胞克隆形成的影響Tab.2 Effects of celastrol on the colony formation of CCL-244 cells x±s

表2 雷公藤紅素處理后對(duì)CCL-244細(xì)胞克隆形成的影響Tab.2 Effects of celastrol on the colony formation of CCL-244 cells x±s

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別對(duì)照組1 μmol/L 2 μmol/L克隆數(shù)量215.00±8.89 166.33±5.51**109.67±10.97**

圖1 雷公藤紅素處理后對(duì)CCL-244細(xì)胞基因表達(dá)的作用Fig.1 Effects of celastrol on the expression of genes in CCL-244 cells

2.4 雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL?244干性相關(guān)蛋白表達(dá)的作用結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，雷公藤紅素組細(xì)胞內(nèi)的干性相關(guān)的蛋白CD133（P＜0.01）和CD44（P＜ 0.01）均呈現(xiàn)明顯下降趨勢。

2.5 雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞CCL?244信號(hào)通路的作用結(jié)果如圖3所示，雷公藤紅素作用后pAKT的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），而對(duì)AKT的表達(dá)則沒有明顯影響。

圖2 雷公藤紅素處理后對(duì)CCL-244細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of celastrol on the expression of proteins in CCL-244 cells

圖3 雷公藤紅素處理后對(duì)CCL-244細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of celastrol on the expression of signaling pathways in CCL-244 cells

3 討論

腸癌已成為惡性腫瘤死亡的第二大因素，5-氟尿嘧啶（5-FU）迄今仍然是臨床上治療腸癌的一線藥物［7］。然而5-FU單藥治療的臨床響應(yīng)率僅為15%左右，因此一般5-FU與其他臨床抗癌藥物合用以增加治療效果，如5-FU與伊立替康或者奧利沙鉑聯(lián)合使用可以使臨床響應(yīng)率提高到40%左右［8］。最新研究結(jié)果顯示，5-FU與bevacizumab和cetuximab聯(lián)合使用可以使對(duì)腸癌的響應(yīng)率達(dá)到60%～70%。但是對(duì)化療藥物的耐藥性仍然是提高腸癌患者生存時(shí)間的主要原因［9］。此外，5-FU與化療藥物聯(lián)合使用常常產(chǎn)生比較嚴(yán)重的副作用。因此，高效的抗腸癌藥物迄今為止仍然存在很大的缺口。中草藥是抗癌藥物分子的重要來源，從中草藥中也發(fā)現(xiàn)了很多重要的抗癌藥物，如紫杉醇等。雷公藤紅素是來源于中藥雷公藤屬植物的單體成分，具有多種生物學(xué)功能，包括抗菌、抗生育、抗炎和抗癌等［10-11］。目前關(guān)于雷公藤紅素抗腸癌機(jī)制的報(bào)道主要是抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等［10-11］，而對(duì)雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞干性的影響鮮有研究。

近年來研究表明，腸癌中存在腫瘤干細(xì)胞，即腸癌干細(xì)胞［3，9］。兩項(xiàng)獨(dú)立的研究結(jié)果顯示，腸癌組織中存在一群CD133+致瘤能力強(qiáng)、自我更新快的腫瘤細(xì)胞，而CD133-的腸癌細(xì)胞曾無法形成腫瘤［3-4，12］。此外，CD133+細(xì)胞在體外能夠在不分化狀態(tài)下維持培養(yǎng)達(dá)1年以上［11］。因此，CD133是腸癌細(xì)胞重要的“干性”標(biāo)記物。近年來，越來越多的研究結(jié)果顯示，這一小群腸癌細(xì)胞除了表達(dá)CD133外，還表達(dá)其他幾種“干性”標(biāo)記物，如CD44、Oct4、ALDH1 等［11，13-14］。在本研究中，以腸癌細(xì)胞CCL-244為細(xì)胞模型，對(duì)雷公藤紅素抑制腸癌細(xì)胞干性進(jìn)行了研究。本研究結(jié)果表明，雷公藤紅素體外能夠抑制腸癌CCL-244細(xì)胞的生長，并且抑制細(xì)胞的克隆形成。機(jī)制研究結(jié)果顯示，雷公藤紅素能夠抑制腸癌細(xì)胞干性標(biāo)記物CD133、CD44和Oct4基因的表達(dá)，降低腸癌細(xì)胞CD133和CD44蛋白的表達(dá)，表明雷公藤紅素對(duì)腸癌細(xì)胞的干性維持具有很好的抑制作用。

AKT信號(hào)通路不僅參與多種重要的細(xì)胞生理過程如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、分化、凋亡、血管生成等，還參與惡性腫瘤細(xì)胞的干性維持［15-16］。所以筆者還探討了雷公藤紅素是否對(duì)AKT信號(hào)通路有作用。本研究結(jié)果顯示，雷公藤紅素能夠明顯地抑制AKT的磷酸化水平，而對(duì)AKT的水平?jīng)]有影響，表明雷公藤紅素可能通過抑制AKT信號(hào)通路來抑制腸癌細(xì)胞的干性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，雷公藤紅素可抑制人腸癌CCL-244細(xì)胞增殖和克隆形成，這可能與抑制干性相關(guān)基因和蛋白CD133、CD44等的表達(dá)、抑制AKT信號(hào)通路有關(guān)。