許璨 劉廠輝 彭曠

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（湖南衡陽421001）

川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是從活血化瘀中藥川芎中提取出來的吡嗪類生物堿，臨床上常用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾?。?］。大量的藥理學(xué)實驗證明川芎嗪能抑制缺血再灌注損傷所致心律失常、縮短心律失常持續(xù)時間、降低室顫和室速的發(fā)生率［2］。呂磊等［3］研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪預(yù)處理明顯降低心肌細胞凋亡指數(shù)及Caspase-3活性、降低Bax mRNA的表達水平，增加Bcl-2 mRNA和磷酸化Akt的表達水平。王萬鐵等［4］研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪通過減少心肌細胞MAO活性，提高線粒體COX活性，從而實現(xiàn)減少線粒體外膜損傷和內(nèi)膜膜電位，減少心肌細胞凋亡［4］。盡管如此，川芎嗪存在易升華、體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等系列問題［5］。黃鵬等［6］研究了磷酸川芎嗪滴丸在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)磷酸川芎嗪滴丸在人體內(nèi)代謝很快，t1/2約為1 h，臨床上需要多次給藥才能維持血藥濃度。故需構(gòu)建一種載藥系統(tǒng)解決川芎嗪的上述問題，同時將藥物靶向聚集在缺血心肌部位，便于藥物進入線粒體發(fā)揮藥理作用。聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物（polyethyleneglycol-polylacticacidglycolicacid，PEGPLGA）具有親水端PEG，親脂端PLGA，兩者連接在一起形成了雙親性高分子藥用材料，在水溶液中可組裝形成納米膠束，外周PEG可以在體內(nèi)長循環(huán)，延長藥物的半衰期，內(nèi)核PLGA為親脂性高分子，能與脂溶性小分子融合在一起，故可承載脂溶性成分［7］。目前，PEG-PLGA納米膠束主要用于遞送腫瘤藥物［8］，缺血心肌部位也存在與腫瘤相似的炎癥細胞浸潤，文獻報道PEG-PLGA在缺血心肌部位也具有良好的EPR效應(yīng)［9］，因而本研究于2017年12月至2018年4月采用PEG-PLGA承載川芎嗪，制備川芎嗪PEG-PLGA納米膠束，通過考察川芎嗪PEG-PLGA納米膠束在急性缺血心肌模型大鼠組織分布，探索該載藥系統(tǒng)的心臟靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑PEG-PLGA（冰河生物科技（上海）有限公司，MW=3 000 Da），川芎嗪原料藥（南京郎澤醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%，批號：20171022），鹽酸川芎嗪對照品（中國食品藥物檢定研究院，批號：110817-201608，純度≥98%），6-甲基香豆素內(nèi)標物（中國食品藥物檢定研究院，批號：520003-201301，純度≥98%），色譜純甲醇購自美國TEDIA試劑公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡（日本電子株氏會社），LC-20 AT高效液相色譜儀（日本島津），BSA224S電子分析天平（德國賽多利斯），TGL20MW臺式大容量高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.3 動物D雄性大鼠，購于南華大學(xué)實驗動物中心，合格證號HUNANSlk 20180511。

1.4 方法

1.4.1 川芎嗪PEG?PLGA納米膠束的制備精密稱取川芎嗪8 mg、PEG-PLGA 80 mg，加入30 mL色譜二氯甲烷使其完全溶解，抽真空，再于40℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成一層均勻干燥薄膜，取下載薄膜的旋蒸瓶再進行冷凍干燥12 h盡量祛除殘留的有機溶劑，吸取適量PBS促使薄膜水合，于40℃水浴下輕微振搖促進水化30 min，轉(zhuǎn)入潔凈西林瓶中超聲20 min，促使粒子分散均勻，采用注射器吸取過0.22 μm微孔濾膜，除去沉淀物，再冷凍干燥24 h，即可獲得川芎嗪 PEG-PLGA 納米膠束［5］。

1.4.2 粒徑、Zeta電位及形態(tài)吸取川芎嗪PEGPLGA納米膠束溶液適量并稀釋，以粒徑儀測定Zeta電位分布和粒徑；同樣的辦法采用移液槍吸取少量川芎嗪PEG-PLGA納米膠束，滴加在銅網(wǎng)上，濾紙吸干溶液，室溫烘干，采用JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡觀察納米膠束的形態(tài)；另外，采用激光光束觀察PEG-PLGA納米膠束是否存在丁達爾現(xiàn)象。

1.4.3 包封率及載藥量將上述制備的川芎嗪PEGPLGA納米膠束置于超濾離心管（MW=3 000 Da）中，高速（10 000 r/min）冷凍離心5 min，離心管外為膠束外游離的川芎嗪，測定含量M游離，離心管內(nèi)為載藥納米膠束，加入適量乙腈破壞納米膠束，釋放川芎嗪，采用HPLC檢測包封的川芎嗪M包，即可計算納米膠束的包封率（EE%），同時將離心管內(nèi)的納米膠束溶液冷凍干燥，然后稱質(zhì)量（M總重），即可計算載藥量（DL%）。

EE%=M包÷（M包+M游離）×100%DL%=M包÷M總重×100%

M游離：離心后游離川芎嗪，M包：膠束中川芎嗪，M總重：川芎嗪PEG-PLGA納米膠束質(zhì)量

1.4.4 臨界膠束濃度（criticalmicelle concentra?tion，CMC）測定 采用天平精密稱取凍干PEGPLGA納米膠束溶于適量，溶解于PBS溶液中，配制成1～12 μg/mL系列濃度PEG-PLGA納米膠束溶液，然后與芘混合，25℃攪拌6 h，采用熒光光度儀檢測芘的發(fā)射光譜I373和I394，根據(jù)各濃度下I394/I373比值，即可獲得納米膠束的 CMC［10］。

1.4.5 體外釋放精密稱取川芎嗪5 mg，采用適量PBS溶解，精密吸取適量體積含川芎嗪水溶液（含0.5 mg川芎嗪）置于Spectrumlabs透析袋（MW=3 000）中，同樣的辦法精密吸取適量川芎嗪PEGPLGA納米膠束溶液（含0.5 mg川芎嗪），也裝入透析袋中，封閉透析袋兩端，再將兩者置于PBS釋放介質(zhì)中，體積大約500 mL，pH值為7.4，調(diào)節(jié)溫度保持在37℃水浴，以100 r/min轉(zhuǎn)速研究膠束的體外釋放行為。于設(shè)定時間點1、3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60 h取樣，每次吸取1 mL進樣檢測，同時補充1 mL的PBS，采用HPLC檢測每次取樣中的川芎嗪濃度，計算累計釋放率。

1.4.6 試驗方法取70只SD大鼠，按體重分成兩組，每組35只，然后將川芎嗪PEG-PLGA納米膠束PBS溶解后，從大鼠的尾靜脈注射給藥，給藥劑量按照各大鼠的體重進行調(diào)整，標準為20 mg/kg，注射給藥5 min后，一組大鼠采用結(jié)扎冠脈的方式制備急性心肌缺血模型，另一組為正常大鼠，分別于注射給藥后30、60、90、120、150、180、210 min這些時間點將大鼠處死5只，迅速解剖，取心、肝、脾、肺、腎、腦組織，按照體重選擇部分組織，保存在-80℃的冰箱中，再按照“組織樣品的處理”項下進行操作，進樣分析后，測定兩組心、肝、脾、肺、腎和腦中川芎嗪含量。

1.4.7 組織樣品的制備取大鼠組織適量，按質(zhì)量（g）與體積（mL）比為1：2加生理鹽水，制成組織勻漿，精密吸取上層勻漿液300 μL，分別加入1 mL色譜甲醇和50 μL 6-甲基香豆素內(nèi)標，渦旋混勻5 min，沉淀蛋白，高速離心（15 000 r/min）5 min祛除蛋白，取上清液800 μL，氮吹儀氣流下吹干，然后再加入50 μL色譜甲醇溶解，高速離心（12 000 r/min）取上清液30 μL進樣，測定組織樣品中的藥物濃度。

1.4.8 色譜條件菲羅門Luna-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），以甲醇和0.1%醋酸水為進行梯度洗脫。洗脫程序為：0～8 min，甲醇：10%～30%；8～10 min，甲醇：30% ～60%；10～12 min，甲醇：60% ～10%；12～13 min，甲醇：10%；柱溫：30℃，檢測波長：250 nm，流速：1.0 mL/min。

1.4.9 方法學(xué)考察及評價

1.4.9.1 專屬性取大鼠空白肝組織、空白肝組織外加合適濃度的川芎嗪對照品和6-甲基香豆素內(nèi)標配制的模擬組織樣品、以及大鼠給藥后采集的組織樣品，按照“組織樣品的制備”方法進行處理，采用上述HPLC條件進行測定，考察色譜條件方法的專屬性。

1.4.9.2 標準溶液的配制精密稱取川芎嗪對照品適量，加色譜甲醇溶解，配制成濃度為100 μg/mL的川芎嗪對照品儲備液，再從中精密吸取100 μL，添加空白組織勻漿液 900 μL，形成10 μg/mL含藥組織勻漿液，再進行稀釋，可獲得含川芎嗪的系列組織標準液，即為 5、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06 μg/g樣品，按照“組織樣品的處理”進行操作，繪制各組織在系列濃度下的標準曲線。

1.4.9.3 精密度和準確度將川芎嗪與大鼠空白肝組織液混合，制成濃度為2、0.5、0.13 μg/g的質(zhì)控（QC）樣品，按照“組織樣品的制備”進行處理，各濃度平行配制5份，連續(xù)配制3 d，進樣分析，計算日內(nèi)精密度和日間精密度，同時計算準確度。

1.4.9.4 穩(wěn)定性考察取上述制備的3個濃度QC樣品，考察樣品凍融循環(huán)3次、-80℃下長期保存20 d、室溫放置12 h下樣品的含量、評估其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 納米膠束表征、載藥量及包封率川芎嗪PEGPLGA納米膠束大小為（15.8±0.9）nm，Zeta電勢為（-20.5±0.4）mV，兩者都呈良好的正態(tài)分布，表明納米膠束制備良好。從TEM電鏡顯示川芎嗪PEGPLGA納米膠束呈現(xiàn)規(guī)則的圓球性，粒徑基本比較均一，少量微?？赡苁请婄R電壓200 kV過高所致，導(dǎo)致形態(tài)大小出現(xiàn)了變化。另外，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束呈良好的丁達爾現(xiàn)象，說明膠束形成良好。經(jīng)含量檢測，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束的載藥量為（4.8±0.5）%，包封率為（86.2±4.1）%，進一步說明納米膠束包載川芎嗪良好，見圖1。

圖1 川芎嗪PEG-PLGA納米膠束的粒徑（a）、Zeta電位（b）、丁達爾現(xiàn)象（c）和透射電鏡（d）Fig.1 Distribution of particle size（a），Zeta potential（b）and Tyndall phenomenon（c）TEM image of TMP-PEG-PLGA micelles（d）

2.2 臨界膠束濃度的測定芘屬于親脂性芳香苯環(huán)內(nèi)化合物，恰好可以包裹于PEG-PLGA納米膠束親脂性內(nèi)核中，根據(jù)圖2曲線的結(jié)果，膠束內(nèi)核中的芘含量隨著PEG-PLGA納米膠束質(zhì)量濃度增大，拐點處為PEG-PLGA納米膠束的臨界膠束濃度（CMC），該濃度下，芘恰好由游離態(tài)逐漸進入膠束內(nèi)核，大約為4.1 μg/mL。

圖2 PEG-PLGA納米膠束的CMC Fig.2 CMC of PEG-PLGA micelles

2.3 體外釋放川芎嗪在透析袋中呈突釋狀態(tài)，在24 h內(nèi)已經(jīng)釋放92.8%，而川芎嗪PEG-PLGA納米膠束先表現(xiàn)為較快釋放狀態(tài)，24 h后釋藥非常緩慢，由此推測PEG-PLGA納米膠束可將川芎嗪緊密包裹在膠束內(nèi)核，故川芎嗪在納米膠束內(nèi)基本呈現(xiàn)緩釋狀態(tài)。

圖3 川芎嗪PEG-PLGA與川芎嗪體外釋放曲線Fig.3 In vitro release profile fo TMP and TMP-PEG-PLGA micelles

2.4 方法專屬性圖4結(jié)果顯示，組織樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)均不影響TMP和6-甲基香豆素內(nèi)標的分離測定，TMP與內(nèi)標的保留時間分別為8.3和10.1 min左右，TMP與內(nèi)標峰形良好，各峰均完全分離，表明方法專屬性良好。

圖4 川芎嗪色譜圖Fig.4 HPLC Chromatograms of TMP：blank liver tissue（a）；blank liver tissue spiked with TMP（8.2 min）and 6-methylcoumarin（9.8 min）（b）；liver tissue sample after administraion of TMP-PEG-PLGA micelle（c）

2.5 標準曲線的建立川芎嗪在0.06～5 μg/g濃度范圍內(nèi)，表1結(jié)果顯示各組織的藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 組織樣品中川芎嗪的標準曲線Tab.1 Standard curves of TMP in difference tissue sample

2.6 精密度和準確度日內(nèi)精密度及日間精密度分別在6.8%、8.4%以內(nèi)，準確度也基本落在87.7%～104.5%范圍之內(nèi)。該結(jié)果表明，該方法的精密度和準確度均比較好。

2.7 穩(wěn)定性TMP在上述3種條件下貯存后，濃度變化小，偏差不超過10%，說明TMP組織樣品在所考察的條件下能穩(wěn)定存在。

2.8 組織分布如圖5所示，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束在主要臟器均有分布，腦內(nèi)分布相對較少，采用DAS 3.0軟件計算生物利用度，結(jié)果見表2，載藥納米膠束在正常大鼠各組織中AUC分布大小順序為肺＞肝＞脾＞心≈腎＞腦，但是，川芎嗪PEGPLGA納米膠束在急性心肌缺血模型大鼠各組織中AUC分布大小順序為肺＞肝＞心＞脾＞腎＞腦，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束在急性心肌缺血模型大鼠心臟AUC為正常大鼠心臟的1.68倍，具有顯著性差異（P＜0.05），由此表明，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束可以將藥物靶向聚集在缺血心肌部位。

圖5 川芎嗪PEG-PLGA納米膠束在正常大鼠（a）與急性心肌缺血模型大鼠（b）中的組織分布Tab.5 Tissue distribution profiles of TMP-loaded PEG-PLGA micelles in normal rats（a）and acute myocardial ischemia model rats（b）

表2 川芎嗪PEG-PLGA納米膠束在在正常大鼠與急性心肌缺血模型大鼠組織中的AUC分布Tab.2 AUC of tissue distribution profile of TMP-load PEGPLGA micelles in normal rats and acute myocardial ischemia model rats x±s

注：與正常大鼠比較，*P＜0.05

組織樣本心肝脾肺腎腦急性心肌缺血模型大鼠5.33±0.22*5.89±0.27 3.75±0.23 7.62±0.31 2.85±0.48 0.16±0.08 AUC0→∞（μg/g·min）正常大鼠3.17±0.35 6.08±0.47 4.68±0.55 8.26±0.42 3.03±0.25 0.21±0.18

3 討論

PEG-PLGA是由聚乙二醇-聚乳酸/羥基乙酸共聚物組成的兩親性嵌段聚合物，核心成分為PLGA，聚乳酸具有親脂性、降解較慢；外周PEG則親水性較好、體內(nèi)可以長循環(huán)，緩慢釋放藥物，故可以使那些水難溶性藥物高效地進入機體組織。另外，PLGA經(jīng)過PEG修飾后，由于PEG具有良好的生物相容性和無免疫原性，可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的清除，進一步延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間［11］。從本研究結(jié)果分析，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束粒徑大小為（15.8±0.9）nm，Zeta電勢為-（20.5±0.4）mV，基本上呈對稱性良好的正態(tài)分布，TEM電鏡直觀表明，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束為形態(tài)規(guī)格的圓球型，由此推測，川芎嗪被牢固包藏在PEG-PLGA納米膠束內(nèi)核中，PLGA能與親脂性的川芎嗪很好的融合在一起，故能形成粒徑大小比較均一的納米膠束［12］。丁達爾現(xiàn)象也證實，PEGPLGA形成了微粒較小的納米膠束，故可對光進行散射，形成了色彩清晰明亮的光束。體外釋放試驗證實，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束呈現(xiàn)緩慢釋放的狀態(tài)。

心肌缺血時會血管內(nèi)膜通透性異常升高，缺血部位的血管壁之間存在間隙，PEG-PLGA高分子在缺血心肌部位具有良好的EPR效應(yīng)［13-15］。憑借該效應(yīng)，PEG-PLGA納米膠束在心肌缺血區(qū)域間隙增大的血管內(nèi)壁自由出入，滲透到缺血心肌部位，加之炎癥部位的血流相對緩慢，外周PEG屬于長鏈狀高分子，可纏繞在缺血心肌細胞周圍，進一步加強藥物載體的滯留作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川芎嗪PEG-PLGA納米膠束在急性心肌缺血模型大鼠心臟中AUC為正常大鼠心臟中的1.68倍。所以，筆者得出PEG-PLGA納米膠束可將藥物蓄積于缺血心肌部位，有助于提高藥物在病變部位的藥理作用的結(jié)論。