植物組織培養(yǎng)中常見污染類型及防控技術探討

劉文靜

摘 要 在植物組織培養(yǎng)過程中，污染問題的存在會對培養(yǎng)材料的生長發(fā)育產生嚴重影響，并造成不同程度的科研、生產損失?；诖耍瑢χ参锝M織培養(yǎng)期間常見的污染類型進行分析研究，并提出科學的防控技術。

關鍵詞 常見污染類型;植物;組織培養(yǎng);污染防控

中圖分類號：S359 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.36.061

植物組織培養(yǎng)，是指借助細胞全能性特點，在人工配置培養(yǎng)基中采取無菌操作對植物的外植體進行接種，然后利用人工控制的方式模擬植物生長環(huán)境，以此實現(xiàn)離體培養(yǎng)的一種方法與技術。隨著植物組織培養(yǎng)科研力度的不斷加大，現(xiàn)階段遺傳改良、種質保存以及植物快繁等領域都涉及到對植物組織培養(yǎng)的應用。而當前植物組織培養(yǎng)的開展，雖然在培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)操作等方面均按照無菌要求標準開展，但是植物組織污染現(xiàn)象時有發(fā)生，不僅影響到實驗成本和效果，甚至對大規(guī)模生產造成影響。因此，進行植物組織培養(yǎng)的深入研究分析，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 植物組織培養(yǎng)常見污染類型

植物組織培養(yǎng)污染是指植物組織培養(yǎng)過程中因培養(yǎng)材料因素或外界微生物的侵染，使得植物組織和培養(yǎng)基滋生雜菌，導致培養(yǎng)實驗最終以失敗而告終。當前植物組織培養(yǎng)中的常見污染具體分為病毒、真菌以及細菌污染。

1.1 細菌污染

作為龐大數(shù)量的微生物群，細菌充斥在我們的生活環(huán)境中，空氣、泥土、水源中都分布著大量的細菌，且不同細菌的大小、形態(tài)存在一定差異。植物組織培養(yǎng)期間出現(xiàn)細菌污染，主要表現(xiàn)為植物材料表面或者是培養(yǎng)基表面產生黏液狀物體或渾濁水跡狀，有時會呈現(xiàn)出泡沫發(fā)酵狀。通常情況下，植物材料在接種后1～2 d就能發(fā)現(xiàn)細菌污染[1]。細菌污染的主要產生因素在于實驗人員接種期間對接種材料以及接種工具使用不當，其中，芽孢桿菌與葡萄球菌是常見的細菌污染種類。

1.2 真菌污染

真菌喜好潮濕、溫度高的環(huán)境，若植物組織培養(yǎng)期間出現(xiàn)真菌污染，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)毛絨狀、絮狀菌斑，并產生不同顏色孢子。真菌污染多在植物材料接種2～3 d可以發(fā)現(xiàn)，會形成較大面積的菌落，產生多顏色的絨毛狀菌斑，并且會散發(fā)出霉味。真菌污染的產生因素在于接種期間的環(huán)境問題，常見真菌污染種類包括青霉菌、黑曲霉菌、芽枝霉菌、酵母菌等[2]。

1.3 病毒污染

病毒常以顆粒形式存在，體積非常小，并且病毒污染的概率也相對較小。在植物組織培養(yǎng)過程中，病毒的污染僅憑肉眼觀察是難以發(fā)現(xiàn)的，需要借助電子顯微鏡來具體觀察[3]。病毒多在細胞內潛伏，并且不會導致整個細胞壞死。植物組織培養(yǎng)期間產生病毒污染的主要因素是外植體。

2 植物組織培養(yǎng)常見污染防控技術

2.1 外植體污染消除

2.1.1 科學合理采集選擇外植體

要想避免因外植體對植物組織培養(yǎng)造成污染，需從源頭處進行污染防控，所以應注重對外植體的科學采集與選擇。在不同環(huán)境下，外植體攜帶細菌的程度存在一定差異，一般針對脫毒植物應采用分生組織進行培養(yǎng)，以降低污染發(fā)生率[4]。而對于采集時間的控制，應盡可能在春季采集外植體，并在晴天中午開展采集作業(yè)。當然，外植體采集環(huán)境最好選擇在室內，或者是采集新生嫩芽，因為春季污染程度相對較低，而且晴天環(huán)境污染程度小于下雨天，室內植物攜帶的細菌少于室外植株。此外，需注意采集前必須用75%酒精對工具、用具以及人員手部進行消毒，降低污染發(fā)生率。

2.1.2 科學預培養(yǎng)外植體

若外植體采集為室外采集，并檢測出外植體污染嚴重，則可以利用室內盆栽的方式來降低污染程度，可采用珍珠巖、蛭石種植，并結合施加抗生素來降低污染程度[5]。需要注意，應控制外植體生長，禁止在室內盆栽中施加肥料，合理控制外植體生長溫度、濕度以及光照。等到外植體抽出新芽后，結合細菌病毒檢測結果選擇是否將其新芽當作外植體。若植株無法進行室內盆栽，則可以利用塑料袋覆蓋，等到植株抽出新芽后，選擇合適外植體。

2.1.3 細致清潔、消毒外植體

等到外植體確定完畢，應開展高效的外植體清潔消毒工作，在盡可能減少對外植體傷害的基礎上，確保其攜帶的微生物被徹底消毒滅殺。在具體清潔消毒過程中，先將外植體表面的泥土污垢用清水沖洗掉，然后進行剪枝，接著將外植體放入燒杯中用洗潔精水浸泡

3 min，之后將其放置于流水狀態(tài)下沖洗30 min，最后在無菌操作臺中用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗后再用0.1%升汞浸泡10～30 min。需要注意，在清潔消毒期間應合理應用與選擇消毒劑，避免消毒劑對外植體產生毒害作用[6]。

2.2 環(huán)境污染防控

2.2.1 熏蒸消毒技術

在開展植物組織培養(yǎng)前，應結合具體情況開展熏蒸處理，合理配置熏蒸液，具體包括高錳酸鉀3～6 g·m-3、甲醛4～6 mL·m-3。熏蒸前，應將實驗室的門窗關閉，然后將事前調配好的甲醛溶液倒入高錳酸鉀溶液中，此時因化學反應會產生大量煙霧，工作人員必須立即避開煙霧，避免對人體造成傷害。等到熏蒸時間達到30 min后，即可停止熏蒸。在植物組織培養(yǎng)期間應保持每月一次的頻率開展熏蒸消毒。

2.2.2 紫外燈照射消毒技術

應及時清理污染培養(yǎng)基、污染物品，保持培養(yǎng)室中清潔干凈，并且保持培養(yǎng)架干凈且無雜物。與此同時，利用次氯酸鈉消毒液對接種室和培養(yǎng)室進行定期消毒。每次接種前用75%酒精噴灑室內促使灰塵降落，然后用紫外燈照射30 min，以此起到消毒的作用。

2.2.3 設備消毒

針對接種室、培養(yǎng)室內工作人員每天接觸的工具、用具必須提前進行消毒處理，而無菌操作臺必須在使用前進行30 min的紫外燈照射，并且對操作臺上各個操作面用75%酒精進行細致擦拭。操作臺的過濾網需要每月一換，切不可在操作臺中隨意堆放物品。需要注意，若操作臺長期未使用，必須在使用前徹底清潔消毒，并對操作臺的滅菌效果進行檢測。若滅菌效果不理想，會直接影響到培養(yǎng)結果，所以必須嚴格按照規(guī)定進行滅菌。

2.3 操作污染管理

2.3.1 人員衛(wèi)生控制

植物組織培養(yǎng)操作人員應保持衛(wèi)生，必須在工作期間定期修剪指甲并勤洗手。在無菌操作區(qū)域，禁止佩戴任何首飾，禁止吸煙、喝水、聽音樂、進食。工作服僅能在無菌環(huán)境內穿著，禁止帶出無菌室。定期進行更衣室的清潔消毒，工作服需保持至少每7 d 1次的清潔消毒次數(shù)。工作人員在進入無菌環(huán)境前，必須用肥皂或洗手液進行手部清潔，等到穿衣完畢后，再次用消毒液進行手部清潔，進而降低外植體受污染的概率[7]。

2.3.2 嚴格執(zhí)行操作規(guī)程

在植物組織培養(yǎng)期間，操作不當也極易導致污染問題出現(xiàn)。所以，在具體操作期間，必須嚴格按照相關規(guī)定要求。1）配制室。培養(yǎng)基必須在培養(yǎng)作業(yè)開展的前2天配制完畢;要定期對天平、pH計、溫度計進行檢查;針對化學藥品的保存，必須保持其存儲環(huán)境溫度在4 ℃;對高壓滅菌鍋等設備的使用，必須按照規(guī)定要求進行。2）培養(yǎng)室。培養(yǎng)室的光照、溫度和濕度必須按照規(guī)定要求合理調整，并對室內溫度、濕度、光照定時記錄。若溫度、濕度過高或過低，應及時采取合理措施進行調整，避免對外植體的生長造成影響。3）操作室。接種前，操作室必須用紫外燈照射30 min，并定期開展地面消毒工作，同時，工作人員需對操作臺的清潔度進行定期檢測，嚴格控制工具、用具的滅菌時間。

3 結語

隨著我國科學技術的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術的應用愈發(fā)廣泛。而要想最大化實現(xiàn)植物組培技術的作用與價值，就需對當前植物組培常見污染進行深入分析，結合科學的污染防控技術來降低植物組織培養(yǎng)期間出現(xiàn)污染的概率。

參考文獻：

[1] 任目瑾，周建峰.植物組織培養(yǎng)的常見污染及其防控技術[J].陜西林業(yè)科技，2016（6）：103-105.

[2] 彭立群，田子珩，張俊琦.植物組培中污染發(fā)生原因及防治技術研究進展[J].廣東林業(yè)科技，2012，28（1）：82-86.

[3] 葉添謀.植物組織培養(yǎng)過程中的常見技術難題研究進展[J].韶關學院學報，2010，31（3）：84-90.

[4] 邵龍珠，趙淑君，王淑榮，等.植物組織培養(yǎng)中的常見問題與解決技術措施[J].林業(yè)勘查設計，2012（1）：49-51.

[5] 潘娟，李先源，李名楊.植物組織培養(yǎng)過程中常見問題及解決方法[J].安徽農業(yè)科學，2009，37（6）：2392-2394.

[6] 趙春莉，李金英.植物組織培養(yǎng)中污染原因及其控制方法[J].吉林農業(yè)科學，2010，35（6）：11-13.

[7] 周權男，姜澤海，李哲，等.植物組織培養(yǎng)中污染控制技術的研究現(xiàn)狀[J].熱帶農業(yè)科學，2012，32（9）：53-56.

（責任編輯：趙中正）