張佩，邵先鋒，王振山，賈辰熙

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高通量質(zhì)譜法用于小鼠器官內(nèi)源性肽的鑒定

張佩1,2，邵先鋒2,3，王振山1，賈辰熙2

1 河北大學 生命科學學院，河北 保定 071000 2 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所 國家蛋白質(zhì)科學中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206 3 天津醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，天津 300070

張佩, 邵先鋒, 王振山, 等. 高通量質(zhì)譜法用于小鼠器官內(nèi)源性肽的鑒定. 生物工程學報, 2019, 35(4): 697–706.Zhang P, Shao XF, Wang ZS, et al. Identification of mouse organ endogenous peptides by high throughput mass spectrometry. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 697–706.

內(nèi)源性肽以細胞因子、生長激素、激素肽等形式在人體的內(nèi)分泌、神經(jīng)、細胞生長和生殖各個領域發(fā)揮功能。神經(jīng)肽是一種內(nèi)源性肽，與痛覺、睡眠、情緒、學習與記憶等生理活動相關，不但存在于腦部神經(jīng)細胞，也存在于其他體液和器官內(nèi)并發(fā)揮重要作用。目前對器官內(nèi)源性肽的研究仍不足，尤其是其中的神經(jīng)肽。文中應用液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜高通量鑒定胰腺、心臟、肝臟和腎臟中內(nèi)源性肽的分布以及神經(jīng)肽的種類。鑒定結(jié)果顯示，在肝臟中內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的數(shù)目最多，而胰腺中最少；所鑒定到的內(nèi)源性肽具有器官特異性，在4個器官中分別呈現(xiàn)不同的動態(tài)分布；4個器官中神經(jīng)肽的LPV (最長肽變異體) 數(shù)目差異較大，而且基因家族的分布也各不相同，比如胰腺中的神經(jīng)肽多屬于Glucagon家族，心臟中的神經(jīng)肽分別屬于ACBD7、Granins、PEBP等幾個家族。鑒定結(jié)果將為疾病的機制研究和治療藥物的研發(fā)提供參考。

器官，內(nèi)源性肽，神經(jīng)肽，高通量鑒定，液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜

內(nèi)源性肽是指源自生物體內(nèi)的活性肽，含量極少且效應強，分布廣泛。內(nèi)源性肽作為體內(nèi)的信號調(diào)節(jié)分子以多種形式存在，比如細胞因子、生長激素、激素肽等，在人體的激素、神經(jīng)、細胞生長和生殖等生理過程發(fā)揮重要功能[1]。目前對于內(nèi)源性肽的研究相對較少，很多內(nèi)源性肽的種類、功能等信息相對缺乏。有些未知功能的內(nèi)源性肽可能是某些疾病的靶點。因此對器官所含內(nèi)源性肽的大規(guī)模鑒定，對闡明其功能有重要意義。

神經(jīng)肽是重要的一類內(nèi)源性肽，主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，并少量存在于體液和外周器官[2]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，與痛覺、睡眠、情緒、學習、記憶等生理活動密切相關，但在外周器官的非神經(jīng)細胞中，神經(jīng)肽對發(fā)育分化營養(yǎng)增殖凋亡具有調(diào)控作用，比如在胃腸道中有胃泌素參與消化，在血管中腎上腺髓質(zhì)素有強大的擴張血管的功能[2-5]。由于神經(jīng)肽含量少且難以提取，所以對外周器官的神經(jīng)肽的研究屈指可數(shù)[6-8]。

近年來，運用質(zhì)譜儀對蛋白質(zhì)組學和肽組學進行大規(guī)模鑒定的方法已經(jīng)成熟，質(zhì)譜法(Mass spectrometry，MS)是利用電場和磁場將運動的離子按自身的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法。與傳統(tǒng)的Western blotting、免疫共沉淀的方法比較，質(zhì)譜法更便利、精準、高效。高靈敏度和高分辨的液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜允許對微量物質(zhì)進行有效分離，是研究生物樣本、檢測疾病藥物必不可少的分析工具，因此成為含量極少的內(nèi)源性肽進行鑒定的最佳選擇[9-16]。

本研究利用基于質(zhì)譜技術(shù)的肽組學方法，對器官內(nèi)的內(nèi)源性肽進行大規(guī)模鑒定，并重點表征神經(jīng)肽，對其數(shù)目和種類及不同器官的區(qū)域性分布進行對比。取小鼠的心臟、肝臟、腎臟和胰腺4種外周器官，通過研磨，利用酸化甲醇去除組織內(nèi)的大蛋白分子，從而提取內(nèi)源性的多肽。為避免大蛋白降解造成的信號污染，整個實驗過程在冰上進行。樣品制備完畢后用液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜法進行器官中內(nèi)源性肽的大規(guī)模鑒定。

1 材料與方法

1.1 小鼠器官的采集

動物：SPF級C57BL/6雄性小鼠，8周齡，體重約35 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于國家蛋白質(zhì)科學中心動物飼養(yǎng)平臺。為了避免環(huán)境改變對小鼠生理穩(wěn)定的影響，購買后飼養(yǎng)1周使小鼠對新的環(huán)境適應保持各個生理指標的平衡。

解剖器官：用水合氯醛 (4%，0.20 mL/20 g) 腹腔注射麻醉小鼠。在體式顯微鏡下結(jié)扎左側(cè)頸外動脈，注射針頭從左側(cè)頸動脈進入頸總動脈，觀察老鼠的呼吸和心跳是否正常，在保證心跳和呼吸正常的情況下平穩(wěn)注入生理鹽水，生理鹽水循環(huán)全身，取心臟、肝臟、腎臟和胰腺。

微波爐加熱[17]：為了去除蛋白酶體外再次酶切造成背景干擾，器官立即在微波爐內(nèi) (800 W，30 s) 加熱使蛋白酶失活[3]，樣品?80 ℃保存。

1.2 內(nèi)源性肽的提取

肽的提取[10]：將器官分別放在玻璃研磨器 (5 mL容量)，加入2 mL酸化甲醇提取液(90% LC/MS級甲醇，9%超純水，1% LC/MS級乙酸),在冰上順時針研磨，直至器官破碎溶解于提取液，水浴超聲2 min，4 ℃、20 000×離心10 min，上清液加入到30 kDa的超濾管，進一步去除大蛋白和脂質(zhì)，收集液蒸干。0.1%甲酸水 (99.9%超純水，0.1%甲酸) 重懸，使用C18反向色譜除鹽 (Agilent，USA)，最后用100 mL洗脫液(45%乙腈，0.1%乙酸，54.9%超純水) 洗脫，蒸干后?20 ℃保存?zhèn)溆?，具體流程如圖1。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)設定

液相為Thermo EASY-nLC1000 (Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)，取500 ng樣品溶于0.1%甲酸水注入液相的C18色譜柱 (預柱內(nèi)C18填料：直徑3 μm，孔徑120 ?，長度為5 cm；分析柱內(nèi)C18填料：直徑1.9 μm，孔徑120 ?，長度為12 cm)，在速度為600 nL/min、時間為65 min的分離條件進行分離，5%–40%的分離液 (0.1%甲酸，99.9%乙腈)，電壓為2.2 kV。

質(zhì)譜為Thermo Q ExactiveTMHF(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)，用MS/MS的采集模式分析肽，一級分辨率為120 000，二級分辨率為15 000，一級的掃面范圍是250–1 800/，每次掃描豐度在前20的離子被29%的碰撞能量進行高能碰撞裂解。自動增益控制目標設置：一級為3×e6和二級為2×e5，最大注入時間：一級和二級都是80 ms，動態(tài)排除時間為13 s，電荷排除：+1、+8、>+8價。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)均使用PEAKS Studio (Version 8.5) 先進行肽段的從頭測序，再進行數(shù)據(jù)庫的搜庫，搜庫參數(shù)設置：前體質(zhì)量最大偏差10 ppm，碎片離子偏差在0.2 Da以內(nèi)，肽段FDR≤1%且-10logP≥20，無酶切，動態(tài)修飾包括Amidation、Oxidation (M)、Phosphorylation (STY)、Acetylation (K)，每條肽段最多允許存在2個動態(tài)修飾。

數(shù)據(jù)庫來源：(1) 內(nèi)源性肽庫：UniProt中小鼠的全蛋白庫，刪除所有神經(jīng)肽的前體。(2) 神經(jīng)肽數(shù)據(jù)庫：a. Swepep[18](http://www.swepep.org/)；b. Neuropedia[19](http://proteomics.ucsd.edu/Software/ NeuroPedia/)；c. Neuropep[20](http://isyslab.info/ NeuroPep/)；d. UniProt小鼠的神經(jīng)肽的前體。

為了重點分析神經(jīng)肽，將神經(jīng)肽庫從內(nèi)源性肽中取出單獨分析。以下所描述的內(nèi)源性肽為不包含神經(jīng)肽的其他內(nèi)源性肽。

2 結(jié)果與分析

用肽組學的方法得到肽的數(shù)目如表1所示，其中，在肝臟中鑒定到的內(nèi)源性多肽和神經(jīng)肽的數(shù)目最多，分別為3 471和427個；胰腺中皆為最少。

圖1 小鼠器官內(nèi)源性肽提取鑒定流程圖

表1 四個器官中內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的鑒定數(shù)目

2.1 內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽在4個器官中的動態(tài)范圍

對所鑒定到的各器官中內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的動態(tài)范圍進行分析，如圖2A所示，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽在不同器官內(nèi)的動態(tài)范圍差別較大。在肝臟中鑒定到的內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽數(shù)目最多，而且動態(tài)范圍最大；而胰腺中的內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽數(shù)目最少。心臟的神經(jīng)肽數(shù)目比胰腺多，但是動態(tài)范圍卻比胰腺要小。相同的內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽在不同器官中的豐度差異同樣很大，例如圖2A中的內(nèi)源性肽的Ferritin (96–114)和有功能的神經(jīng)肽Little-SAAS的豐度差異，神經(jīng)肽Little-SAAS[21]在心臟中高豐度表達，但是在腎臟中豐度較低。此分析結(jié)果表明器官間內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的分布存在較大的組織區(qū)域性，充分證明了肽組學方法的高效性。

2.2 內(nèi)源性肽豐度的累積分布

為了分析器官內(nèi)源性肽在總體水平的分布情況，對內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的豐度進行排序，作出累積分布圖。圖2B為內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的累積分布圖，示意為4個等級：Q1表示前25%，Q2表示25%–50%，Q3表示50%–75%，Q4表示75% –100%。在4個器官的神經(jīng)肽的分布中，有功能的全長肽Thymosin-beta-4分別占胰腺、心臟和腎臟的累積豐度第一位，肝臟中的排列是第四。Thymosin-beta-4[22]具有增強細胞免疫功能和調(diào)節(jié)免疫平衡等作用，在器官內(nèi)發(fā)揮重要功能。4個器官累積豐度最高的前3個神經(jīng)肽的具體信息如表2所示。

2.3 四個器官共同鑒定到的肽以及肽的器官特異性

將所有的內(nèi)源性肽、內(nèi)源性肽所對應的前體蛋白和神經(jīng)肽分成4個區(qū)域：共同存在于4個器官、共同存在于3個器官、共同存在于2個器官和只存在于1個器官的特異性的肽。結(jié)果見圖3，其中的外層數(shù)據(jù)圓是所有的內(nèi)源性肽和內(nèi)源肽對應的蛋白前體，內(nèi)部4個數(shù)據(jù)圓是內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽分別相對應的器官分布注釋。4個器官共有肽的數(shù)目相對較少，僅為45條，而且共有的蛋白前體 (45條肽來源的蛋白前體) 僅有25個。表3為4個器官中共有的內(nèi)源性肽前體蛋白。器官特異性的內(nèi)源性肽和其前體蛋白的數(shù)目較多，表4為每個器官中豐度最高的前5個器官特異性內(nèi)源肽的蛋白前體。將所有器官特異性肽的蛋白前體作GO分析 (圖3A內(nèi)部)，取每個器官中高度富集的前5個生物過程，發(fā)現(xiàn)不同器官中特異性內(nèi)源肽來源的蛋白前體所參與的生物過程有顯著差異。胰腺和心臟中的蛋白前體大多參與細胞成分和染色體等的產(chǎn)生過程，腎臟中大多數(shù)蛋白前體參與有機氮、酰胺以及核苷酸的合成，而肝臟中的蛋白前體多參與細胞代謝等過程。

圖3B為神經(jīng)肽的器官區(qū)域性分布，4個器官共有的神經(jīng)肽為3條，器官特異性的神經(jīng)肽較多，表5中將每個器官中豐度最高的前3個器官特異性神經(jīng)肽列出。所有鑒定到的神經(jīng)肽中有6條為功能已報道的完整神經(jīng)肽，其中Thymosin-beta-4和Little-SAAS共存同在于4個器官內(nèi)。Little-SAAS[21]與神經(jīng)晝夜節(jié)律相關，同樣在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。在腎臟中有3條特異性的功能性完整肽：緩激肽(Bradykinin)[23]、血管緊張素-1 (Angiotenxin-1)[24]和神經(jīng)肽Y (Neuropeptide-Y)[25-27]，這3條肽都與心血管疾病密切相關。

表2 四個器官中累積分布排名前三的神經(jīng)肽

Top1,2 and 3 are the top three peptides in the abundance of each organ, and Top1 is the most abundant peptide.

圖3 四個器官中內(nèi)源性肽及其蛋白前體和神經(jīng)肽的分布

表3 四個器官共有的內(nèi)源性肽的前體蛋白

表4 豐度最高的前5個器官特異性內(nèi)源性肽的前體蛋白

表5 豐度最高的前3個器官特異性神經(jīng)肽前體

內(nèi)源性肽的組織特異性與蛋白水平特異性可能與其基因的表達豐度有一定關聯(lián)，且與蛋白的降解動力學有關[1,28]。

2.4 內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽主成分分析

主成分分析旨在利用降維的方法，把多種因素轉(zhuǎn)化成幾種成分，其中每個主成分都能夠反映原始數(shù)據(jù)的真實信息。主成分數(shù)據(jù)投影到一個二維或者三維的空間內(nèi)，反映樣本間的相關性。內(nèi)源性肽主成分分析圖中 (圖4) 胰腺和腎臟的距離較近，而在神經(jīng)肽主成分分析圖中心臟和腎臟的距離比較近。通過主成分分析，充分展示了器官之間在內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽角度的相似性和差異性。

圖4 四個器官中內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽的主成分分析

2.5 最長肽變異體 (LPV) 分析

非特異性蛋白酶切割會產(chǎn)生階梯特征的肽序列，為了進一步降低數(shù)據(jù)的復雜性，Secher等開發(fā)了LPV算法[9]。將器官內(nèi)所鑒定到的神經(jīng)肽進行LPV分析 (圖5A)，胰腺、心臟、腎臟和肝臟中LPV數(shù)目分別為23、54、126和300。胰腺和心臟中鑒定到的神經(jīng)肽的總數(shù)量差異不顯著，但是LPV的數(shù)目相差較大，說明心臟中由非特異性蛋白酶產(chǎn)生的階梯序列較少。4個器官LPV分布情況如圖5B所示，共有的LPV序列僅有1條，序列為SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNP LPSKETIEQEKQAGES。

2.6 神經(jīng)肽的基因家族分析

根據(jù)www.neuropeptides.nl網(wǎng)站[29]對神經(jīng)肽基因家族的分類，將4個器官中鑒定到的所有神經(jīng)肽進行分類，標出神經(jīng)肽數(shù)目前10個家族 (圖6)。胰腺中的神經(jīng)肽多屬于Glucagon家族，心臟中的神經(jīng)肽分別屬于ACBD7、Granins、PEBP等幾個家族。腎臟中的神經(jīng)肽極少數(shù)屬于Thymosin家族且均勻分布在其他家族。肝臟中的神經(jīng)肽在每個家族都有分布，但在Glucagon中較少。此結(jié)果顯示器官之間神經(jīng)肽基因家族分布存在較大差異，也說明器官內(nèi)的神經(jīng)肽由于基因家族特異性分布而發(fā)揮不同的功能。

圖6 神經(jīng)肽的基因家族分析

3 討論

本研究對胰腺、心臟、肝臟和腎臟4個器官的內(nèi)源性肽進行大規(guī)模鑒定，并對其中的種類、數(shù)目分布等進行分析，同時對4個器官內(nèi)的神經(jīng)肽進行了表征。結(jié)果顯示，肝臟的內(nèi)源性肽數(shù)目最多且與細胞代謝密切相關；肝臟中神經(jīng)肽的數(shù)目也是最多，且基因家族呈均值分布，這些神經(jīng)肽在體內(nèi)參與了較多的生理功能。胰腺中內(nèi)源性肽和神經(jīng)肽數(shù)目都是最少的，其內(nèi)源性肽大多參與體內(nèi)細胞合成等基本功能，其神經(jīng)肽70%分布在Glucagon家族，對血糖的調(diào)控具有重要作用。近年來科學家發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1 (Glucagon-like peptide-1，GLP-1)[30-31]對神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用，希望將來研究出以GLP-1為靶點的新型抗慢性疼痛藥物，減輕慢性疼痛患者痛苦。在心臟中，神經(jīng)肽主要分布在ACBD7、Adipose、Granins、PEBP等幾個基因家族，阿片肽(Adipose)一直是近年來神經(jīng)生物學研究的熱點[1-2]，它們對機體的心血管功能、內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)以及消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等都具有重要作用。腎臟中除了與其他器官共有的具有功能性的完整肽以外，還包含3條具有腎臟特異性的功能性完整肽。緩激肽 (Bradykinin)[23]是一種有效的內(nèi)皮依賴性血管舒張劑，能降低血壓。它還會導致支氣管和腸道內(nèi)非血管平滑肌的收縮，增加血管通透性，并參與疼痛機制。緩激肽也會引起鈉尿，導致血壓下降。已經(jīng)有研究表明血管緊張素-1 (Angiotenxin-1)[24]與血管機能具有密切聯(lián)系。神經(jīng)肽Y (Neuropeptide-Y)[25]在原發(fā)性高血壓、充血性心力衰竭、冠心病、糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中有著極其重要的病理生理學意義。這3個出現(xiàn)在腎臟中的功能性的完整神經(jīng)肽都與心血管疾病相關，在預防和治療一些心血管疾病具有重要的意義。在神經(jīng)肽的PCA分析中，腎臟和心臟的距離最近，由此可見腎臟中和心臟中神經(jīng)肽以及功能之間具有密切聯(lián)系。

內(nèi)源性肽尤其是神經(jīng)肽在人體中發(fā)揮重要功能，是疾病診斷、預防、治療的關鍵，也是藥物研發(fā)的重要靶點。隨著技術(shù)的發(fā)展，先進的儀器和更高效的純化方法不斷被開發(fā)并應用于蛋白質(zhì)組學和肽組學。本研究對器官內(nèi)源性肽的探索將為未來內(nèi)源性肽機制的深入研究提供參考。

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Identification of mouse organ endogenous peptides by high throughput mass spectrometry

Pei Zhang1,2, Xianfeng Shao2,3, Zhenshan Wang1, and Chenxi Jia2

1 School of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071000, Hebei, China 2 Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, Beijing 102206, China 3 Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Endogenous peptides, in the form of cytokines, growth hormones and hormone peptides, play an important role in human hormones, nerves, cell growth and reproduction. Neuropeptide is a kind of endogenous peptide, which is related to the physiological activities of pain, sleep, emotion, learning and memory. Neuropeptides exist not only in the nerve cells of the brain, but also in other body fluids and organs. At present, there is still a lack of research on endogenous peptides, especially on neuropeptides. In this study, high-throughput liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to identify the distribution of endogenous peptides in the pancreas, heart, liver and kidney as well as the types of neuropeptides. The results showed that the number of endogenous peptides and neuropeptides in the liver was the highest while that of the pancreas was the lowest. The identified endogenous peptides were organ-specific and presented different dynamic distribution in four kinds of organs. The number of LPV (Longest peptide variant) of neuropeptide in the four organs varies greatly, and the distribution of gene family is also different. For example, neuropeptide in pancreas belongs to Glucagon family, while neuropeptide in heart belongs to ACBD7, Granins, PEBP and other families. The identification results will provide reference value for the mechanism study of diseases and the research and development of therapeutic drugs.

organ, endogenous peptide, neuropeptide, high-throughput identification, LC-MS/MS

10.13345/j.cjb.180377

September 13, 2018;

November 13, 2018

National Key R&D Program of China (Nos. 2017YFA0505702, 2016YFA0501302), National Natural Science Foundation of China (No. 21675006).

Chenxi Jia. E-mail: cja@mail.ncpsb.org

Zhenshan Wang. E-mail: zswang@hbu.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃 (Nos. 2017YFA0505702, 2016YFA0501302)，國家自然科學基金 (No. 21675006) 資助。

2018-12-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20181207.1331.004.html

(本文責編 陳宏宇)