• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看

      ?

      箭筈豌豆品種間遺傳差異的SSR分析及指紋圖譜構(gòu)建

      2019-04-23 07:19:22閔學(xué)陽韋興燚劉文獻(xiàn)張正社金小煜NDAYAMBAZABoniface吳洪林李昱王彥榮
      草業(yè)學(xué)報(bào) 2019年4期
      關(guān)鍵詞:豌豆多態(tài)性圖譜

      閔學(xué)陽,韋興燚,劉文獻(xiàn),張正社,金小煜,NDAYAMBAZA Boniface,吳洪林,李昱,王彥榮

      (蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

      遺傳育種材料來源的選擇,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、遺傳改良具有重要意義,另外,遺傳多樣性很大程度上決定了種質(zhì)資源的豐富度,是物種適應(yīng)外界環(huán)境和進(jìn)化的前提;同時(shí),遺傳多樣性研究能夠反映栽培物種的育種水平、發(fā)現(xiàn)新的基因資源和改良現(xiàn)有的育種材料[1-3]。近年來,隨著分子生物學(xué)的興起,DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于植物分類、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析等研究中[4-6]。其中,簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)分子標(biāo)記具有共顯性、單堿基高分辨率、操作簡單、重復(fù)性好、可檢測等位基因和隨機(jī)均勻分布在擴(kuò)增基因組內(nèi)等優(yōu)點(diǎn),已成為植物雜交育種和種群遺傳多樣性等研究領(lǐng)域中最常用的分子標(biāo)記之一[7-8]。因此,利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析物種遺傳差異,將為物種遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種的研究奠定基礎(chǔ)。

      箭筈豌豆(Viciasativa)作為一種重要的一年生、自花授粉、二倍體豆科牧草,具有生育周期短、較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益,同時(shí)具有固氮、改善土壤結(jié)構(gòu)、廣泛的適應(yīng)性和良好的抗寒能力,是一種優(yōu)良的飼草和綠肥兼用牧草,在土耳其、中國、中亞、南美等地區(qū)普遍種植[9-11]。但目前對箭筈豌豆遺傳結(jié)構(gòu)及群體多樣性的研究相對較少,分子標(biāo)記數(shù)量十分有限,遠(yuǎn)不能滿足箭筈豌豆遺傳多樣性研究與分子育種工作的需要。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展和成本的降低,基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘有價(jià)值的SSR位點(diǎn)已在多種植物中得到了成功驗(yàn)證。

      轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)是一類能夠直接或間接與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用,能夠激活或抑制下游被調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[12-13]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和基因組學(xué)工具的開發(fā)使用,許多物種的轉(zhuǎn)錄因子已被鑒定和注釋。截至目前,已從高等植物中分離鑒定出100多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[14]。由于轉(zhuǎn)錄因子的可用性、連續(xù)富集和明確的功能域,可作為優(yōu)異的候選基因用于開發(fā)基于基因功能的微衛(wèi)星標(biāo)記[6]。迄今為止,轉(zhuǎn)錄因子分子標(biāo)記只在鷹嘴豆(Cicerarietinum)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中被研究報(bào)道,并且這些標(biāo)記已被證明在標(biāo)記輔助遺傳改良和品種鑒定中具有很大的潛力[6,15]。

      新《種子法》的實(shí)施明確規(guī)定,申請審定的農(nóng)作物品種應(yīng)具備特異性(distinctness)、一致性(uniformity)、穩(wěn)定性(stability)簡稱DUS,DUS測試結(jié)果已成為農(nóng)作物品種審定登記的必要條件。在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗(yàn)示范(國家草品種區(qū)域試驗(yàn))項(xiàng)目的資助下,本團(tuán)隊(duì)開展了箭筈豌豆品種的評價(jià)和測試分析試驗(yàn)。為了從分子水平研究箭筈豌豆品種間基因型的差異,本研究采用基于箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘的轉(zhuǎn)錄因子SSR引物,利用30份箭筈豌豆品種構(gòu)建品種指紋圖譜,并在此基礎(chǔ)上對品種間的遺傳相似性進(jìn)行分析,從分子水平上為箭筈豌豆品種的鑒定和保護(hù)提供更加準(zhǔn)確、公正和客觀的判定依據(jù)。同時(shí)印證基于箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定其轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而開發(fā)SSR標(biāo)記的可行性,以期為箭筈豌豆遺傳多樣性分析、品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建提供有價(jià)值的候選標(biāo)記。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      本研究所用的30個(gè)箭筈豌豆品種由國內(nèi)和國外兩部分構(gòu)成。其中,20份國外品種來源于美國農(nóng)業(yè)部,10份國內(nèi)品種來源于中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國畜牧總站和國家草種質(zhì)資源庫(表 1),上述箭筈豌豆品種均種植于蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)站,實(shí)驗(yàn)材料在2017年5月采集于榆中校區(qū)試驗(yàn)田。

      1.2 基因組DNA的提取

      每個(gè)箭筈豌豆品種采集10個(gè)單株的新鮮葉片分別提取基因組DNA[6,16]。提取后的DNA經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量,并用Nanodrop分光光度計(jì)測定DNA濃度和質(zhì)量(OD260/OD280≈1.8)。將檢測合格的DNA樣品稀釋至50 μg·L-1,最后把同一品種的10份DNA稀釋液等體積混合,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 轉(zhuǎn)錄因子和SSR位點(diǎn)鑒定及引物設(shè)計(jì)

      用于鑒定箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子和開發(fā)SSR分子標(biāo)記的44582條箭筈豌豆 Unigene序列下載于NCBI Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫,登錄號(hào)為:No.GSE35437。豆科植物轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列下載于豆科轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(legume transcription factor database, Legume TFDB)。利用本地BLAST程序(E-value=10-10)與箭筈豌豆Unigene進(jìn)行比對,鑒定箭筈豌豆中潛在的轉(zhuǎn)錄因子基因。分別通過MicroSAtellite(MISA, http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具和Primer 3軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)識(shí)別和引物設(shè)計(jì)[17]。

      表1 箭筈豌豆品種鑒定試驗(yàn)材料Table 1 V. sativa cultivars in the experiment

      注:品種類型均為育成品種。

      Note: Variety types are cultivar.

      1.4 功能注釋

      將所獲得的箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子中含SSR位點(diǎn)并且能夠成功設(shè)計(jì)引物的Unigene序列,通過Blast2GO[18]和WEGO軟件進(jìn)行功能注釋[19]。

      1.5 PCR擴(kuò)增與檢測

      引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SSR-PCR擴(kuò)增體系為10 μL,在Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀(德國)上進(jìn)行:2×Taq PCR MasterMix 5 μL,正反向引物各1 μL (10 μmol·L-1),模板DNA 1 μL (50 ng·μL-1),ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃變性30 s后,62~54 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸30 s,共8個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s后,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min;于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

      1.6 數(shù)據(jù)分析

      通過人工比對和軟件校正,對SSR 標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。按照擴(kuò)增條帶的分子量從大到小編號(hào)讀取,相同遷移位置有帶的記為1,無帶的記為0,建立“0,1”矩陣,并統(tǒng)計(jì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)(total bands, TB)、預(yù)計(jì)雜合度(expected heterozygosity, He)和多態(tài)信息量(polymorphic information content, PIC)[20]。用Quantity One軟件根據(jù)marker分子量計(jì)算特異擴(kuò)增條帶的分子量,通過Originpro 8軟件把“0,1”數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)模式圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子SSR分子標(biāo)記開發(fā)

      將箭筈豌豆Unigene序列與大豆(Glycinemax)、百脈根(Lotuscorniculatus)和蒺藜苜蓿的轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行本地BLAST比對,得到34個(gè)潛在的箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄因子家族,共1816個(gè)基因(表 2)。通過MISA軟件對Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢測,其中SSR位點(diǎn)對應(yīng)重復(fù)的一、二、三、四、五和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5;同時(shí),兩個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100 bp時(shí),組成一個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。在282個(gè)Unigene中共檢測到306個(gè)SSR位點(diǎn),采用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),最終208對SSR引物在188個(gè)Unigene序列中成功設(shè)計(jì)。對檢測到的SSR位點(diǎn)的類型和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表 2),SSR位點(diǎn)具有三堿基重復(fù)類型的數(shù)量最多,共121個(gè),占SSR位點(diǎn)重復(fù)類型的58.17%;其次分別為單堿基重復(fù)類型(45,21.63%)、二堿基重復(fù)類型(24,11.54%),無四、五和六堿基重復(fù)類型。

      表2 箭筈豌豆SSR標(biāo)記開發(fā)匯總Table 2 Summary of SSR search results for V. sativa

      2.2 含有SSR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子功能分類

      使用Blast2GO和WEGO軟件對188個(gè)箭筈豌豆Unigene序列進(jìn)行了功能注釋(圖1)。在本研究中,共有156(82.98%)條Unigenes得到了GO注釋,包括細(xì)胞組分(cellular component,110個(gè)),分子功能(molecular function,147個(gè))和生物學(xué)過程(biological process,117個(gè)),所有的匹配序列被進(jìn)一步富集為28個(gè)功能類別,細(xì)胞組分分類中,細(xì)胞和細(xì)胞成分功能類別中(cell and cell part)均注釋到109個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列,其次為細(xì)胞器(organelle,102個(gè))?;诜肿庸δ艿姆诸悓⑥D(zhuǎn)錄因子基因分為5組:蛋白結(jié)合(binding,133個(gè)),轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(transcription regulator activity,54個(gè)),催化活性(catalytic activity,13個(gè)),轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity,2個(gè))和結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity,1個(gè))。在生物過程分類中,兩個(gè)代表性最高的GO術(shù)語是細(xì)胞過程(cellular process,109個(gè))和代謝過程(metabolic process,108個(gè)),其次是生物調(diào)節(jié)和生物過程調(diào)節(jié)(biological regulation and regulation of biological process,均為101個(gè))。

      2.3 SSR產(chǎn)物多態(tài)性分析

      用208對成功設(shè)計(jì)的SSR引物對30份箭筈豌豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析(表3),共鑒定得到35對可擴(kuò)增出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好和譜帶清晰的引物(圖2)。每對引物的擴(kuò)增帶數(shù)從3(VsTFSSR-10、-14、-16和-26)到18(VsTFSSR-24)不等,平均值為8.23。35對引物的多態(tài)性位點(diǎn)百分比均達(dá)到了100%;多態(tài)信息含量(PIC)范圍為 0.42(VsTFSSR-26)~1.00(VsTFSSR-01、-05和-08),平均值為0.80;預(yù)計(jì)雜合度(He)范圍為0.53(VsTFSSR-26)~1.00(VsTFSSR-01、-05和-08)。

      圖1 含有SSR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子GO分類Fig.1 GO classifications of TFs genes containing SSR

      引物編號(hào) Primer ID重復(fù)序列 Motif引物序列 Primer sequence (5′-3′)目標(biāo)條帶Product size (bp)總條帶數(shù)Totalbands預(yù)計(jì)雜合度He多態(tài)信息含量 PIC轉(zhuǎn)錄因子家族 Transcription factor familyVsTFSSR-01(ACA)6F:TCAAAACCTTAAACGCTCCGR:GGAACTATTGGATCGGGGTT23081.001.00ERFVsTFSSR-02(CTT)5F:TTCATCAGAACCACCAAAAGCR:CAAAATCCGGCGACTATGTT19440.980.98bHLHVsTFSSR-03(ATC)5F:TCCACCTTCTCTTTCAGATTCTCR:CCGTGAGTTTGATGACGATG27660.990.99G2-likeVsTFSSR-04(CAA)5F:GCAACGCAGAACTCTTTTCCR:TCCGTCTCGAAGCTCTTGTT14540.890.88TCPVsTFSSR-05(TTG)5F:TGGTTGGTAACGAGGGATGTR:CCTCAACAACTCGCCAATCT21391.001.00C2H2VsTFSSR-06(CAA)5F:ATGGCTCATCGTCATCATCAR:TGGTTTTGTGTTTGGGGATT199150.900.89MYBVsTFSSR-07(TGT)5F:TGTTTTCCACATGTTTGTGTCAR:CCACAAATCCACCAAGGTTT156110.850.83TALEVsTFSSR-08(CAT)6F:GAAATCAGTCTTCCAAACAACATR:TGGATTCCAAAGCTCTTTTCC13981.001.00G2-likeVsTFSSR-09(AAC)6F:TCCGAGGTCTGTTCAAAAGGR:ATTTTCCCACCGACACACAT157130.730.69ERFVsTFSSR-10(T)10F:AAAGAGGGTTTACGGTGGCTR:CCAAATCTTTTCTCTCCATTCC21230.890.89ERFVsTFSSR-11(CAT)5F:CCAAACAAACCATCTTTGCATR:AAACCCAAGAACCCCAACTC18240.930.93ERFVsTFSSR-12(GGT)6F:GGTTGAATTCATGCGATGTGR:GATCTATACGGCCGAGCAAC27040.670.61GRAS

      續(xù)表3 Continued Table 3

      圖2 部分VsTFSSR引物的擴(kuò)增圖譜Fig.2 Amplification results by part of VsTFSSR primers A: VsTFSSR-12; B: VsTFSSR-19; C: VsTFSSR-22; D: VsTFSSR-23; E: VsTFSSR-26; F: VsTFSSR-28; G: VsTFSSR-31.

      2.4 箭筈豌豆品種聚類分析

      利用NTSYS-pc 2.10軟件的UPGMA法對30個(gè)箭筈豌豆品種進(jìn)行聚類分析(圖3),不同品種間的遺傳相似系數(shù)(Nei-Li/Dice系數(shù))范圍為0.69~0.95,表明不同品種之間存在著豐富的遺傳多樣性。首先,30份箭筈豌豆品種被聚為兩大類:國內(nèi)品種和國外品種,其中,蘭箭1號(hào)箭筈豌豆在聚類分析中與國外品種聚為一類,表明蘭箭1號(hào)箭筈豌豆相較于其他國內(nèi)品種具有更為豐富的遺傳背景。根據(jù)聚類結(jié)構(gòu)進(jìn)一步將30個(gè)箭筈豌豆分為6個(gè)類群,其中A類群有5個(gè)品種,均來自前蘇聯(lián);B類群共有5個(gè)品種,3個(gè)品種來自法國,1個(gè)來自美國,1個(gè)來自中國;C類群共有4個(gè)品種,3個(gè)來自匈牙利,1個(gè)來自日本;D類群共4個(gè)品種,3個(gè)來自美國,1個(gè)來自匈牙利;E類群共9個(gè)品種,均來自中國;F類群共3個(gè)品種,2個(gè)來自美國,1個(gè)來自匈牙利。 聚類分析結(jié)果表明,所選用的35對SSR引物具有很好的區(qū)分效果,可初步將不同地理起源的品種進(jìn)行區(qū)分。

      2.5 VsTFSSR引物鑒定箭筈豌豆品種效率分析

      利用35對引物在30個(gè)箭筈豌豆品種的電泳帶型進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)性分析結(jié)果如圖4所示。引物VsTFSSR-10與VsTFSSR-26、VsTFSSR-14與VsTFSSR-26之間相關(guān)性最強(qiáng),相關(guān)系數(shù)為0.89,表明這兩對引物間擴(kuò)增帶型差異最??;而VsTFSSR-9與VsTFSSR-24之間相關(guān)性最低,相關(guān)系數(shù)為-0.27,表明擴(kuò)增帶型差異最大。不同引物間的相關(guān)性分析可進(jìn)一步輔助在品種鑒定時(shí)進(jìn)行引物間的優(yōu)化組合,通過選取相關(guān)性較低的引物組合可以提高引物組合的鑒別效率。例如VsTFSSR-6能夠區(qū)分7個(gè)品種,VsTFSSR-18能夠區(qū)分5個(gè)品種,兩對引物間的相關(guān)性系數(shù)為0.28,兩對引物組合可以區(qū)分11個(gè)箭筈豌豆品種。

      圖3 30份箭筈豌豆品種VsTFSSR引物聚類分析Fig.3 Dendrogram of 30 V. sativa cultivars based on VsTFSSR primers

      圖4 35對VsTFSSR引物擴(kuò)增結(jié)果相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analyzes based on the 35 VsTFSSR primers amplification product 1~35表示引物VsTFSSR-01~VsTFSSR-35。1-35 indicated the primer ID from VsTFSSR-01 to VsTFSSR-35.

      2.6 核心引物確定

      在篩選出的35對VsTFSSR多態(tài)性引物中,每個(gè)箭筈豌豆品種至少在1對VsTFSSR引物中具有特異性條帶,即該品種可以用1對或1對以上的引物與其他所有箭筈豌豆品種進(jìn)行區(qū)分(圖5)。例如引物VsTFSSR-24能擴(kuò)增出18個(gè)多態(tài)性條帶,一次性可以區(qū)分19個(gè)品種;VsTFSSR-30擴(kuò)增出13個(gè)多態(tài)性條帶,一次性可以區(qū)分15個(gè)品種;VsTFSSR-35擴(kuò)增出15個(gè)多態(tài)性條帶,一次性可以區(qū)分12個(gè)品種。通過對引物擴(kuò)增的特異性條帶數(shù)和不同引物間的相關(guān)性進(jìn)行分析,確定利用6對引物(VsTFSSR-21、VsTFSSR-23、VsTFSSR-24、VsTFSSR-30、VsTFSSR-34和VsTFSSR-35)就可將所有的30個(gè)箭筈豌豆品種區(qū)分開,這6對引物可作為箭筈豌豆品種指紋圖譜構(gòu)建的核心引物。以篩選出的6對核心引物擴(kuò)增電泳圖譜為基礎(chǔ),由 1和 0 組成的字串構(gòu)成數(shù)字指紋,再經(jīng)Originpro 8軟件轉(zhuǎn)換,建立了基于6對引物擴(kuò)增的蘭箭1號(hào)、蘭箭2號(hào)和蘭箭3號(hào)品種標(biāo)準(zhǔn)模式圖(圖6)。根據(jù)每個(gè)品種的特異性帶型,可以比較容易地鑒定區(qū)分,如VsTFSSR-24、VsTFSSR-30和VsTFSSR-35中的一對引物就可以將上述3個(gè)品種完全區(qū)分開。

      圖5 30個(gè)箭筈豌豆品種特異性識(shí)別引物數(shù)量Fig.5 The number of the VsTFSSR primers specifically identified in 30 V. sativa cultivars

      圖6 基于6對核心引物擴(kuò)增的3個(gè)箭筈豌豆品種指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)模式圖Fig.6 Mode image of fingerprintings for three V. sativa cultivars by six core primer pairsA: 蘭箭1號(hào) Lanjian1; B: 蘭箭2號(hào) Lanjian2; C: 蘭箭3號(hào) Lanjian3.

      2.7 箭筈豌豆品種指紋圖譜構(gòu)建

      統(tǒng)計(jì)6對核心引物在30個(gè)箭筈豌豆中擴(kuò)增的1,0數(shù)據(jù),將6對引物擴(kuò)增結(jié)果組合在一起即為箭筈豌豆的DNA指紋圖譜。如用6對SSR引物擴(kuò)增TYESISSKAYA品種,在6對引物中得到的圖譜分別為0000100、00000000100、000000000000000010、0100010000010、000001000和000000011001000,將其組合到一起為0000100-00000000100-000000000000000010-0100010000010-000001000-000000011001000(表 4),得到由“0”和“1” 組成的73個(gè)數(shù)字圖譜。利用組合的數(shù)字圖譜構(gòu)成了30個(gè)箭筈豌豆品種的組合指紋圖譜數(shù)據(jù)庫,當(dāng)30條字符串形成能夠唯一標(biāo)識(shí)的字符串時(shí),即表明這6對VsTFSSR引物能將30份箭筈豌豆品種全部區(qū)分開,每一條字符串可以作為每一份箭筈豌豆的分子身份證號(hào)碼。

      表4 30個(gè)箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of the 30 V. sativa cultivars

      3 討論

      相比其他類型的分子標(biāo)記,SSR分子標(biāo)記以其獨(dú)特優(yōu)越性,從2005年起就被國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)推薦作為建庫優(yōu)選的標(biāo)記,因此在品種鑒定上具有較高的權(quán)威性[21-22]。隨著后基因組時(shí)代的到來,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已被廣泛用于研究模式和非模式植物的生長發(fā)育以及對逆境脅迫響應(yīng)的機(jī)制研究[23-24]。通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)的 SSR 標(biāo)記具有 EST-SSR 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)還可以提高植物遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確性。相對于其他豆科牧草,如苜蓿(Medicagosativa)、三葉草(Trifolium)、百脈根和草木樨(Melilotussuaveolens)等,目前對箭筈豌豆遺傳結(jié)構(gòu)及群體多樣性的研究相對較少,分子標(biāo)記數(shù)量十分有限,遠(yuǎn)不能滿足箭筈豌豆遺傳多樣性研究與分子育種工作的需要。同時(shí),傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法具有耗時(shí)長、需要專門的技術(shù)人員、易受環(huán)境條件限制、需要大量的土地面積等缺點(diǎn)。目前以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)已被成功地運(yùn)用于水稻(Oryzasativa)、茶樹(Camelliasinensis)、苜蓿和棉花(Gossypiumspp.)等植物的品種鑒定中[25-28]。

      本研究首先通過生物信息學(xué)鑒定了箭筈豌豆 Unigene序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而檢測了轉(zhuǎn)錄因子序列中的SSR位點(diǎn),利用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),成功獲得208對轉(zhuǎn)錄因子SSR引物,最終從208對SSR引物中篩選獲得35對條帶清楚、擴(kuò)增效果穩(wěn)定的多態(tài)性引物。研究表明當(dāng)PIC值大于0.5可作為信息標(biāo)記,當(dāng)PIC值大于0.7可用于構(gòu)建遺傳圖譜[29]。在本研究中,35對SSR引物的PIC平均值為0.80,除VsTFSSR-26(PIC=0.42)引物的PIC值小于0.5,其余引物的PIC值均大于0.5;其中27個(gè)(77.14%)引物的PIC值大于0.7,表明基于轉(zhuǎn)錄因子開發(fā)的多態(tài)性分子標(biāo)記在箭筈豌豆遺傳多樣性和遺傳圖譜分析中具有較大的潛力。Kim等[30]對兩個(gè)箭筈豌豆亞種(V.sativassp.sativa和V.sativassp.nigra)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,在兩個(gè)亞種中分別選取100對引物,并分別在9個(gè)V.sativassp.sativa和 9個(gè)V.sativassp.nigra亞種中對開發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行評價(jià),PIC值為0.38~0.75,在兩個(gè)箭筈豌豆亞種中的平均PIC值分別為0.54 (sativa)和0.51 (nigra);Chung等[31]利用高通量測序在箭筈豌豆中獲得17971條序列,從中鑒定得到2429個(gè)SSR位點(diǎn),共設(shè)計(jì)并合成了100對cDNA-SSR引物。在32份箭筈豌豆材料中篩選出49對多態(tài)性引物,PIC的范圍為0.20~0.86,平均值為0.59;Liu 等[32]用96對EST-SSR引物在10個(gè)箭筈豌豆材料中進(jìn)行擴(kuò)增,PIC的范圍為-0.09~0.98,平均值為0.70;Liu等[6]在44個(gè)苜蓿品種中評估了27個(gè)多態(tài)性TFGM(transcription factor gene-derived microsatellite)分子標(biāo)記,PIC值為0.08~0.84,平均值為0.60。而本研究篩選出的35對VsTFSSR引物在30個(gè)箭筈豌豆品種中的PIC平均值為0.80,均高于以上研究結(jié)果,表明VsTFSSR標(biāo)記在箭筈豌豆遺傳多樣性分析中優(yōu)于其他類型的SSR標(biāo)記。

      對引物擴(kuò)增的特異性條帶數(shù)和不同引物間的相關(guān)性進(jìn)行分析,確定了6對核心引物用于構(gòu)建30個(gè)箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜。把6對SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果組合在一起就可以將30個(gè)箭筈豌豆品種完全區(qū)分開,即每個(gè)箭筈豌豆品種都有能夠唯一標(biāo)識(shí)的一份品種字符串。目前UPOV已為箭筈豌豆制定了DUS測試指南,國內(nèi)箭筈豌豆的DUS測試指南正在研制中,因此箭筈豌豆SSR引物的開發(fā)和指紋圖譜的構(gòu)建可以為SSR標(biāo)記技術(shù)在箭筈豌豆DUS測試中應(yīng)用奠定基礎(chǔ),在箭筈豌豆品種鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面發(fā)揮積極作用,同時(shí)在育種策略調(diào)整和選配優(yōu)良雜交組合培育新品種等方面具有現(xiàn)實(shí)意義。

      4 結(jié)論

      本研究利用箭筈豌豆 Unigene序列鑒定潛在的轉(zhuǎn)錄因子基因,設(shè)計(jì)開發(fā)SSR引物;并從中篩選獲得35對多態(tài)性引物,證明基于箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定其轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而開發(fā)SSR標(biāo)記的可行性。最終用6對核心引物構(gòu)建了30個(gè)箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜。本研究可以從分子水平快速準(zhǔn)確鑒別和了解箭筈豌豆品種的遺傳差異,進(jìn)而為合理利用箭筈豌豆種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

      猜你喜歡
      豌豆多態(tài)性圖譜
      單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
      繪一張成長圖譜
      豌豆
      大灰狼(2018年5期)2018-06-20 14:49:32
      豌豆笑傳
      補(bǔ)腎強(qiáng)身片UPLC指紋圖譜
      中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:09:01
      豌豆笑傳之拔罐
      主動(dòng)對接你思維的知識(shí)圖譜
      馬鈴薯cpDNA/mtDNA多態(tài)性的多重PCR檢測
      GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
      豌豆笑傳之吃飯不說話
      滦南县| 大化| 深泽县| 和林格尔县| 巩义市| 类乌齐县| 巴彦淖尔市| 盱眙县| 肇州县| 彭州市| 通化县| 曲阳县| 曲沃县| 景谷| 广南县| 江西省| 旅游| 广东省| 江安县| 宝清县| 盖州市| 柳河县| 灌阳县| 天水市| 罗城| 湘潭县| 张家川| 廉江市| 富川| 济阳县| 四子王旗| 孟津县| 九台市| 正安县| 南宫市| 赣榆县| 诏安县| 泽库县| 安义县| 冀州市| 宁德市|