朱秀紅，王美紅，孫喜營，楊金橘，茹廣欣

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002)

目前，城鎮(zhèn)化的擴(kuò)張、工業(yè)化的建設(shè)造成環(huán)境土地壓力越來越大，人們?cè)絹碓街匾曽}堿地的改造和利用，積極解決土壤鹽漬化的環(huán)境問題[1]。中國有超過3 000萬 hm2土地屬于鹽堿地[2]，鹽漬化土壤抑制植物的生長發(fā)育，造成植物產(chǎn)量銳減[3]。因此，提高植物的耐鹽性顯得尤其重要。鹽脅迫對(duì)植物的傷害表現(xiàn)在4個(gè)方面，滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)元素缺失和氧化脅迫，最終導(dǎo)致植物的生長發(fā)育被抑制甚至死亡[4]。Han等[5]報(bào)道，鹽漬化的土壤主要通過植物組織的離子毒害和滲透脅迫來影響植物生長。鹽脅迫最先傷害植物根系的細(xì)胞質(zhì)膜，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的選擇透過性、穩(wěn)定性的傷害成為直接原初鹽害[6]。植物組織中過多Na+的積累，打破細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的離子平衡，對(duì)植物產(chǎn)生毒害影響[7]。

泡桐(PaulowniaSieb.et Zucc)作為一種速生木材，在中國分布廣泛，具有較強(qiáng)的耐干旱能力和適應(yīng)能力。但關(guān)于‘泡桐1201’對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，特別是關(guān)于根系離子平衡鮮見報(bào)道，因此，探究鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗生長的生理響應(yīng)情況與適應(yīng)機(jī)制，了解‘泡桐1201’鹽脅迫下離子應(yīng)答機(jī)制，為選育耐鹽堿性作物，大力推廣該樹種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊‘泡桐1201’號(hào)種子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以‘泡桐1201’幼苗為研究對(duì)象，在鹽濃度為0～200 mmol·L-1進(jìn)行脅迫處理，每50 mmol·L-1設(shè)置1組，共5組，測(cè)定幼苗的生理指標(biāo)以及根系離子流速。

種子用次氯酸鈉浸泡30 s左右，無菌水反復(fù)沖洗4～5次后，將沖洗凈的種子浸泡在無菌水中催芽5～7 d后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)向培養(yǎng)皿中補(bǔ)水。待種子萌發(fā)至子葉展開后，將發(fā)芽的種子接種于(對(duì)照組)鹽脅迫濃度分別為 0、50 mmol·L-1、100 mmol·L-1、 150 mmol·L-1和200 mmol·L-1的MS培養(yǎng)基中。取30 d的幼苗測(cè)定其生長指標(biāo)、抗氧化性指標(biāo)和離子流速。

1.3 測(cè)定方法

生長指標(biāo)為株高、主根長度以及根、莖、葉的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用乙醇提取比色法[8]。SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[9]。POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[10]。MDA的質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[11]。CAT酶活性測(cè)定采用雙氧水法[12]。離子流速采用非損傷微測(cè)技術(shù)測(cè)定根尖Na+、K+、H+和Ca2+流速[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

鹽脅迫處理設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置 3 個(gè)操作重復(fù)。生長指標(biāo)的測(cè)定方法為每個(gè)處理測(cè)量10棵，抗氧化酶活性測(cè)定每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，離子流速測(cè)定每個(gè)處理重復(fù)5次。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan’s法進(jìn)行處理間的差異顯著性比較。柱狀圖的繪制使用Origin 8.0軟件，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗生長情況的影響

植物的生物量可以反映出植物的生長情況，鹽脅迫濃度越大，植物受到的迫害越嚴(yán)重，干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的減少量越大[14]。由表1可知，鹽脅迫下，各項(xiàng)生長指標(biāo)均低于對(duì)照組。幼苗的株高、根長隨鹽脅迫濃度的增大而逐漸下降。在鹽濃度為50 mmol·L-1時(shí)，幼苗株高和根長降低不明顯，在鹽脅迫濃度為100 mmol·L-1、150 mmol·L-1和200 mmol·L-1時(shí)，株高分別顯著降低14.6%、27.2%和44.3%，主根長分別顯著降低14.0%、41.4%和 62.8%。在植株生長的過程中，根系首先接觸鹽分，所以根系受到的抑制最明顯，隨著鹽分的增加，主根長受到的脅迫越明顯，主根長越短。

表1 鹽脅迫下‘泡桐1201’幼苗生長情況Table 1 Growth of‘P.1201’ seedling under salt stress

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters represent significant difference(P<0.05). The same below.

2.2 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

葉綠素在植物的光合作用中發(fā)揮著重要作用，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)少的植物光合能力弱，同時(shí)用葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)來衡量植物抗逆性[15]。由圖1可以看出，鹽脅迫使‘泡桐1201’幼苗綠素a明顯降低，隨鹽脅迫濃度的增加，呈下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，葉綠素a在鹽脅迫濃度為50 mmol·L-1變化不明顯，在150 mmol·L-1和200 mmol·L-1濃度下，分別降低43.8%和58.6%。葉綠素b變化不大，與葉綠素a變化趨勢(shì)一致。類胡蘿卜素隨著鹽脅迫濃度增加，質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少。葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在鹽脅迫濃度為100 mmol·L-1時(shí)下降趨勢(shì)較顯著，與對(duì)照組相比下降28.8%。在高濃度鹽脅迫下，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于對(duì)照。在鹽脅迫濃度為200 mmol·L-1時(shí)，植物受到較為嚴(yán)重的外界脅迫，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，光合作用能力減弱。

2.3 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗SOD活性的影響

SOD活性反應(yīng)植株活性氧基清除能力的大小，與作物抗鹽性有密切聯(lián)系[16]。植株體內(nèi)自由基的清除能力可通過增大SOD和POD活性降低對(duì)細(xì)胞的損害。由圖2可知，SOD活性隨鹽脅迫濃度變化而變化，先增強(qiáng)后減弱。在50 mmol·L-1鹽脅迫濃度下，與對(duì)照組相比，葉片和根尖SOD活性差異不顯著。在濃度為100 mmol·L-1時(shí)，SOD活性最高，葉片的SOD活性相比對(duì)照組顯著增加26.6%，‘泡桐1201’植株的SOD活性增幅較大，此時(shí)植株表現(xiàn)較強(qiáng)的抗性。SOD活性都隨著鹽脅迫濃度的增大呈先增加后降低的趨勢(shì)。根尖的SOD活性變化趨勢(shì)與葉片中的基本一致。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同 Different lowercase letters represent significant difference(P<0.05).The same below

圖1鹽脅迫下‘泡桐1201’葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)
Fig.1Chlorophyllmassfractionof
‘P.1201’undersaltstress

圖2 鹽脅迫下‘泡桐1201’SOD活性Fig.2 SOD activity of‘P.1201’ under salt stress

2.4 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)保護(hù)酶的一種，在植物體中活性很高，通過將植物體內(nèi)自由基生成的過多的過氧化物分解為水和氧，以降低過氧化物對(duì)細(xì)胞和組織的毒害性[17]。由圖3可知，在鹽濃度為50 mmol·L-1時(shí)‘泡桐1201’幼苗中POD活性顯著升高。當(dāng)鹽脅迫濃度為100 mmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，POD活性升高66.8%。在150 mmol·L-1時(shí)較100 mmol·L-1POD活性下降 28.6%。在200 mmol·L-1時(shí)葉片中POD活性下降至最低，達(dá)244 U·g-1。根尖和葉片在50 mmol·L-1時(shí)與對(duì)照組差異較大，此時(shí)POD活性達(dá)到最大值。在鹽脅迫濃度超過50 mmol·L-1時(shí)，隨著鹽脅迫濃度的增加POD活性顯著下降，表明此時(shí)鹽脅迫已經(jīng)超過植物的自我保護(hù)范圍，影響植物的生長。

圖3 鹽脅迫下‘泡桐1201’POD活性Fig.3 POD activity of‘P.1201’ under salt stress

2.5 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

MDA是植物體組織發(fā)生膜脂過氧化后的最終產(chǎn)物，與植物的抗性呈負(fù)相關(guān)，MDA質(zhì)量摩爾濃度的多少可以判斷在鹽脅迫下膜結(jié)構(gòu)受傷害的程度，MDA質(zhì)量摩爾濃度越多膜結(jié)構(gòu)損害程度越大，進(jìn)而判斷植物的抗逆性差[18]。由圖4可以看出，在鹽脅迫濃度為0～200 mmol·L-1時(shí)，葉片和根部MDA質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。在200 mmol·L-1濃度下，MDA質(zhì)量摩爾濃度最大達(dá)到3.36 μmol·g-1。在鹽脅迫濃度為50～100 mmol·L-1時(shí)，MDA根部質(zhì)量摩爾濃度無明顯變化，當(dāng)鹽脅迫濃度高于100 mmol·L-1一定范圍后，隨著鹽濃度的增加，MAD質(zhì)量摩爾濃度也顯著增加，MDA質(zhì)量摩爾濃度較低的植株具有較強(qiáng)的抗性。在鹽脅迫濃度為200 mmol·L-1時(shí)，MAD質(zhì)量摩爾濃度最高，說明此時(shí)‘泡桐1201’幼苗的膜脂過氧化傷害最嚴(yán)重，受到的迫害最嚴(yán)重。

2.6 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗CAT活性的影響

在植物的生長過程中，CAT發(fā)揮著重要作用，該酶是植物體內(nèi)一種重要的氧化還原酶。主要清除植物通過呼吸作用和光合作用等途徑產(chǎn)生的過氧化物，同時(shí)CAT主要負(fù)責(zé)植物葉綠體細(xì)胞外的過氧化物，維持活性氧代謝的平衡，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[19-20]。由圖5可知，在50 mmol·L-1鹽脅迫濃度下CAT活性變化不明顯，但是當(dāng)鹽脅迫濃度達(dá)到100 mmol·L-1時(shí)，CAT活性升高。在濃度較低的50 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)，植物的抗性能力較強(qiáng)，在植物自身的防御機(jī)制內(nèi)，CAT活性顯著升高。但是達(dá)到100 mmol·L-1時(shí)，鹽脅迫對(duì)植物造成迫害，產(chǎn)生較多的過氧化物，植物自身的防御機(jī)制啟動(dòng)，因此CAT活性升高抵抗鹽脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的有害物質(zhì)。隨著鹽濃度的不斷升高，超過植物自身的調(diào)節(jié)機(jī)能，過氧化物產(chǎn)生過多，破壞植物細(xì)胞體內(nèi)抗氧化性酶的合成，導(dǎo)致CAT酶活性隨之降低。

圖4 鹽脅迫下‘泡桐1201’MDA質(zhì)量摩爾濃度Fig.4 MDA mass molality of‘P.1201’ under salt stress

圖5 鹽脅迫下‘泡桐1201’CAT活性Fig.5 CAT activity of‘P.1201’ under salt stress

2.7 鹽脅迫對(duì)‘泡桐1201’幼苗根尖離子流速的影響

土壤中高濃度的鹽分不利于根系吸收水分，植物組織中的高濃度鹽分會(huì)導(dǎo)致離子毒。鹽脅迫條件下，由于植物吸收了較多的Na+和Cl-，從而降低了對(duì)K+、Ca2+和Mg2+的吸收，打破了植物體內(nèi)動(dòng)態(tài)的離子平衡[21]。進(jìn)而影響其細(xì)胞的生長和光合作用的傳遞，抑制多種細(xì)胞質(zhì)酶的合成，造成一定程度的單鹽毒害。本研究利用非損傷微測(cè)技術(shù)(NMT)，對(duì)‘泡桐1201’根系分生區(qū)0～600 μm處掃點(diǎn)，正值表示離子外流，負(fù)值表示離子內(nèi)流，測(cè)得流速為離子進(jìn)出植物細(xì)胞的凈流速值。在距離根尖200 μm和600 μm處離子相對(duì)較活躍，所以測(cè)定該位點(diǎn)的離子流速。

由圖6可知，‘泡桐1201’幼苗Na+均為外排。在鹽脅迫濃度為50 mmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，距根尖200 μm和600 μm處Na+的外排速率顯著增加，泡桐幼苗根系Na+的排出主要是由質(zhì)膜逆向轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加提高Na+的排出。在600 μm處測(cè)得離子外排速率普遍高于200 μm處，并且在150 mmol·L-1和200 mmol·L-1處Na+外排速率逐漸減少。

K+流速如圖6顯示，均為外排，隨著鹽脅迫濃度的增加，流速顯著增大。200 μm和600 μm處K+流速差異不大，試驗(yàn)組流速均大于對(duì)照組，并且差異顯著。鹽脅迫濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí)，200 μm和600 μm處K+流速都達(dá)到最大，分別為2 277 pmol·cm-2·s-1和2 641 pmol·cm-2·s-1。

H+的流速圖顯示(圖6)，對(duì)照組在200 μm和600 μm處H+表現(xiàn)為內(nèi)流，流速為4 pmol·cm-2·s-1和5 pmol·cm-2·s-1。在其他試驗(yàn)組，H+隨著鹽脅迫的濃度增大內(nèi)流速率先增加后降低，在100 mmol·L-1鹽脅迫處理下最高，200 μm和600 μm處H+內(nèi)流速率分別為33 pmol·cm-2·s-1和34 pmol·cm-2·s-1。

在200 μm和600 μm處，Ca2+均為內(nèi)流(圖6)。鹽脅迫濃度為50 mmol·L-1的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在200 μm和600 μm處Ca2+流速增加差異不顯著，當(dāng)鹽脅迫濃度超過50 mmol·L-1時(shí)，隨著鹽脅迫濃度的增加，流速顯著增加。在距離根尖200 μm和600 μm處，流速最大值是鹽脅迫濃度為200 mmol·L-1，分別達(dá)到163 pmol·cm-2·s-1和136 pmol·cm-2·s-1。

圖6 鹽脅迫下‘泡桐1201’根尖Na+、K+、H+、Ca2+流速Fig.6 Na+,K+,H+ and Ca2+ flux rate in root tip of ‘P.1201’ under salt stress

3 討 論

本研究結(jié)果表明，用0～200 mmol·L-1濃度鹽脅迫30 d可以明顯抑制‘泡桐1201’幼苗的生長，株高、根長、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量隨鹽脅迫濃度的增大而逐漸下降。在50 mmol·L-1鹽處理時(shí)，‘泡桐1201’幼苗生長指標(biāo)降低不明顯，植物能夠正常生長，說明‘泡桐1201’幼苗對(duì)低鹽脅迫有一定的耐受性。但在鹽濃度高于100 mmol·L-1時(shí)，株高、主根長、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量顯著降低，表明‘泡桐1201’耐鹽能力一般，并且鹽脅迫強(qiáng)度越大，干物質(zhì)量降低幅度越大，與 Qadir等[22]研究結(jié)論一致。

植物在鹽脅迫的影響下，會(huì)通過各種代謝途徑和表型的變化去維持生命活動(dòng)。特別是高鹽脅迫使植物細(xì)胞內(nèi)的水勢(shì)高于細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞失水，植物細(xì)胞內(nèi)的離子含量升高，引起植物細(xì)胞內(nèi)的葉綠素和光合作用相關(guān)的酶解離，導(dǎo)致光合作用下降，影響植物生長發(fā)育，影響程度由植物耐鹽性決定[23-26]。植物體內(nèi)在正常生長過程中會(huì)通過產(chǎn)生活性氧來維持自由基的產(chǎn)生與消除，防御系統(tǒng)的能力，取決于SOD、POD和CAT等保護(hù)酶的相互協(xié)調(diào)作用達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡[27]。本研究結(jié)果表明，‘泡桐1201’幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽脅迫濃度的增加而減小；MDA質(zhì)量摩爾濃度隨著鹽脅迫濃度增加而增大，并且與前人[28-29]對(duì)麻瘋樹和紅樹的研究結(jié)果一致。SOD、POD 和 CAT 活性都隨著鹽脅迫濃度的增大呈先增加后降低的趨勢(shì)，與郭瑞等[30]研究結(jié)果一致。并且‘泡桐1201’幼苗 SOD 和 CAT 活性在 100 mmol·L-1時(shí)都達(dá)到最大值。原因可能是低鹽可以誘導(dǎo)SOD和CAT活性增強(qiáng)，抗性氧化酶活性升高，清除過量的氧自由基等活性物質(zhì)[31-32]。當(dāng) 鹽 脅迫達(dá)到 150 mmol·L-1時(shí)，SOD、POD 和 CAT 酶活性都顯著降低，MDA質(zhì)量摩爾濃度升高，植物膜脂過氧化作用增強(qiáng)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，各種保護(hù)酶的活性均下降，植物生長受到抑制[33]。本研究中，POD 活性在鹽濃度為50 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，說明POD在‘泡桐1201’幼苗內(nèi)對(duì)鹽脅迫濃度較為敏感，耐受閾值低。由此推測(cè)，‘泡桐1201’幼苗抗鹽脅迫的酶促機(jī)制可能是SOD和CAT起主要作用，也可能是由于SOD、POD、CAT三者不能協(xié)調(diào)一致完成活性氧的清除，導(dǎo)致‘泡桐1201’幼苗抗氧化能力減弱，從而引發(fā)一系列活性氧傷害?！萃?201’幼苗在低濃度鹽脅迫下能夠正常生長，但是隨著鹽脅迫濃度的增加，生長受到抑制，這與劉雅輝等[34]在蒲公英上的研究結(jié)果一致。

Na+能夠維持植物的離子平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓；H+在生理調(diào)節(jié)過程中有重要的意義，是生理調(diào)節(jié)的重要表現(xiàn)，調(diào)節(jié)pH和電化學(xué)梯度?！萃?201’幼苗受到鹽脅迫，Na+主要為外排，H+主要表現(xiàn)為內(nèi)流，Ca2+隨著鹽脅迫濃度的增加，內(nèi)流速率顯著增大，但是隨著鹽脅迫的濃度增大K+外排速率增大。Ashraf等[35]研究表明，高等植物質(zhì)膜上的H+-ATPase水解ATP 產(chǎn)生能量，將H+從細(xì)胞質(zhì)中泵出，從而產(chǎn)生跨質(zhì)膜的H+電化學(xué)勢(shì)梯度，H+順著電化學(xué)勢(shì)梯度進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)，Na+逆著電化學(xué)勢(shì)梯度被排出細(xì)胞，從而保持細(xì)胞內(nèi)較低的Na+含量，以此來維持植物細(xì)胞的離子平衡，降低鹽脅迫對(duì)植物的危害。植物細(xì)胞質(zhì)中的K+/Na+平衡對(duì)細(xì)胞代謝和抵御鹽脅迫都起著重要作用[36]。但是隨著鹽脅迫濃度的增加，‘泡桐1201’根部細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，更多的Na+被留在根部細(xì)胞，過多的Na+導(dǎo)致‘泡桐1201’細(xì)胞中Ca2+進(jìn)入減少，K+/ Na+平衡遭到破壞，離子平衡紊亂，進(jìn)而對(duì)植物產(chǎn)生不可逆的傷害。植物根系積累過多的Na+會(huì)產(chǎn)生離子毒害，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，降低毒害作用，從而增加其抗逆能力[37]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，輕度鹽脅迫(50 mmol·L-1)下，‘泡桐1201’幼苗各生長指標(biāo)和綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低不顯著，葉片和根部內(nèi) SOD、CAT 清除活性氧活力增強(qiáng)，有效抵御鹽脅迫傷害，維持植株的正常生長，可作為低鹽土壤環(huán)境改良樹種引種栽培；但隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加，雖然葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成被激發(fā)，質(zhì)膜損害嚴(yán)重，穩(wěn)定性下降，抗氧化酶活性受到抑制，離子穩(wěn)態(tài)干擾加劇，‘泡桐1201’幼苗生長受到抑制，甚至在高鹽(200 mmol·L-1)脅迫下出現(xiàn)植株枯萎死亡。綜上，‘泡桐1201’幼苗對(duì)鹽脅迫濃度較敏感，但對(duì)低濃度的鹽脅迫具有一定的耐受性。

Ding等[38]研究表明，植物SOS1編碼質(zhì)膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要負(fù)責(zé)鹽脅迫下 Na+的主動(dòng)外排，NHX1編碼液泡膜定位的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，可將 Na+運(yùn)入液泡，形成區(qū)隔化，降低胞質(zhì)中 Na+的濃度，從而達(dá)到自我調(diào)節(jié)防御機(jī)制來抵制鹽脅迫的危害。關(guān)于離子流動(dòng)力以及所涉及的基因在不同時(shí)刻的表達(dá)對(duì)植物的抗逆性密切相關(guān)，在以后的試驗(yàn)里可以開展研究。