徐 微張 鑫潘 磊陳培豐#

1 浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

2 河南省新密市中醫(yī)院 河南 新密 452370

3 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

蛇六谷，又名魔芋，性味辛寒，有小毒，具有化痰散結、行瘀消腫止痛等功效，作為抗癌中藥在浙滬地區(qū)廣泛使用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蛇六谷中魔芋葡甘露聚糖(KGM)含量最多，約占50%～60%，是蛇六谷抗腫瘤作用的主要成分[1]。本實驗在建立Lewis肺癌小鼠動物模型的基礎上，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測KGM對荷瘤小鼠脾細胞核轉錄因子-κB（NF-κB）、核因子-κB抑制因子（IκB）表達的影響，為KGM的抗腫瘤作用提供一定的分子學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物:SPF級近交C57BL/6純系小鼠50只，雄性，6～8周齡，體重16～20g；Lewis荷瘤小鼠4只，均購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。動物合格證號:SCXK:（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于我校動物實驗中心SPF級動物房。

1.2 實驗藥物:純化魔芋微粉，成都市圣特蒙魔芋微粉有限責任公司，批號:140305，KGM含量為98%。環(huán)磷酰胺（CTX），0.2g/瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產，批號:04141103。

1.3 試劑及儀器:RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，美國Gibco公司；紅細胞裂解液，Beyotime公司；PBS（磷酸鹽緩沖液），吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；小鼠NF-κB ELISA和IκB ELISA試劑盒，上海翔升生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模及分組方法:在無菌條件下，頸椎脫臼法處死4只荷Lewis肺癌小鼠，取生長良好的新鮮腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，剪碎，勻漿，過濾制成混懸液，離心后加生理鹽水，將細胞濃度調整至1×107/ml。在無菌條件下以0.2ml/只（含瘤細胞數(shù)2×106個）接種于50只C57BL/6小鼠右側腋窩皮下，30min內完成。接種24h后，將50只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組，分別為荷瘤空白對照組（NS組），陽性對照組（環(huán)磷酰胺組，CTX組），KGM低、中、高劑量組，每組10只并稱重。

2.2 給藥方法:參考林慧敏等[2]的給藥方法，將KGM溶于水，其中KGM低、中、高劑量組分別按100mg/(kg·d)、200mg/(kg·d)、300mg/(kg·d)連續(xù)灌胃13d，每日總量0.2ml；生理鹽水組以等劑量灌胃生理鹽水13d；環(huán)磷酰胺組給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算，以30mg/kg腹腔注射給藥，2次/周，共計4次。

2.3 脾臟標本采集:給藥后第14d頸椎脫臼處死小鼠，置于75%的酒精中浸泡5min，在超凈工作臺上，用無菌剪刀快速剪開小鼠皮膚，以新的無菌剪刀剪開腹膜，取出脾臟，放入液氮中冷凍備用。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測脾臟細胞中NF-κB和IκB-α的表達:分述如下。

2.4.1 蛋白提取:采用液氮充分研磨脾組織，加入200μl蛋白提取緩沖液（50mM Tris HCl pH 7.6，1mM CaCl2，0.2%Triton X-100，0.5mM PMSF），充分振蕩混勻，室溫裂解10min。離心機轉速調整至12000rpm，離心10min，離心結束后將上清液轉至新的離心管中，放于-80℃冰箱備用。

2.4.2 蛋白濃度測定分析:①配置統(tǒng)一的蛋白質標準品（規(guī)格見表1）:以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的標準品溶液（濃度為2mg/ml）制作蛋白質濃度標準曲線。分別吸取BSA標準品溶液0μl、25μl、50μl、125μl、150μl、350μl、375μl、395μl 和400μl，各自加入0.01MPBS溶液補足到2000μl，配成梯度濃度的標準品溶液，分裝后-20℃保存，備用。②配制BCA工作液:計算所需要的總BCA工作液體積?？侭CA工作液體積=（BSA標準品+待測樣品）×重復數(shù)×每個樣品所需要的BCA工作液；將BCA試劑A和B按照50∶1的體積比混合均勻，注意二者混合后迅速渾濁，混勻后混合物迅速變澄清。將上述步驟所得混合工作液裝入密封容器內，室溫條件24h穩(wěn)定。

表1 配置BSA標準品體系

2.4.3 微孔板檢測方法（樣品:BCA工作液=1∶8）:各取10標準品和待測樣品加入到微孔板中（即1∶20），試劑盒的檢測范圍為125～2000μg/ml。注意:待測樣品要先稀釋一定的倍數(shù)再進行測量，稀釋的倍數(shù)需進行摸索。在每孔中加入200μl BCA工作液，振蕩30s混合均勻。蓋上微孔板，37℃條件下孵育30min。室溫冷卻，在酶標儀上的562nm波長范圍處檢測吸光度。繪制標準曲線，計算蛋白濃度。

2.5 統(tǒng)計學方法:采用SPSS17.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，最終結果以±s的形式表示，樣本符合正態(tài)分布且方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義差異。

3 結果

3.1 成功建立小鼠移植瘤模型:接種7d后可在各小鼠腋窩皮下觸及米粒大小的結節(jié)，質硬，活動度一般，邊界清楚，表面凹凸不平，連續(xù)觀察13d，期間小鼠腋下結節(jié)增大明顯，表示移植瘤接種成功，符合實驗要求。

3.2 KGM對荷瘤小鼠脾細胞NF-κB、IκB表達的影響：見表2。

表2 KGM對荷瘤小鼠脾臟細胞NF-κB、IκB表達的影響（±s，pg/ml）

表2 KGM對荷瘤小鼠脾臟細胞NF-κB、IκB表達的影響（±s，pg/ml）

注:與NS組比較，☆P＜0.05，△P＜0.01；與CTX組比較，▲P＜0.01。

IκB表達量39.28±5.95▲64.04±6.55△45.78±2.98▲49.01±3.91☆▲66.96±5.69△組別NS組CTX組KGM低劑量組KGM中劑量組KGM高劑量組例數(shù)10 10 10 10 10 NF-κB表達量360.83±16.71▲245.35±24.35△334.79±15.59▲316.13±29.83☆▲246.41±10.76△

4 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)KGM可有效抑制荷瘤小鼠瘤體的生長，提高荷瘤小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，而且荷瘤小鼠脾細胞中T細胞增殖分化也有顯著提高；還可能通過影響THP-1源巨噬細胞白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）mRNA及蛋白的表達來達到免疫調節(jié)的作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。故提高荷瘤小鼠的免疫功能可能是KGM抗腫瘤的機制之一。關于KGM的抗腫瘤機制應該還有很多，本實驗則嘗試從抑制腫瘤血管生成方面探討KGM的可能作用機制。

抑制腫瘤血管生成是防止腫瘤侵襲及轉移、改善患者預后和提高生存率的重要措施之一。目前研究已發(fā)現(xiàn)30余種促血管生成因子，其中血管內皮細胞生長因子（VEGF）是重要的因子之一。NF-κB是一類普遍存在的轉錄調節(jié)因子，有抑制凋亡、促進腫瘤細胞增殖、血管生成和轉移等作用。VEGF的表達與NF-κB成正相關，在腫瘤的血管形成中NF-κB起著核心作用，可通過上調核心因子VEGF的表達來促進腫瘤血管形成。而NF-κB的激活受其抑制因子——IκB(尤其是IκB-α)的調控。IκB可通過與NF-κB二聚體結合，形成NF-κB/IκB復合物。外源性刺激通過活化IκB激酶（IKK）使得IκB磷酸化，并進一步降解，使NF-κB發(fā)生核異位，與靶基因的特異位點相結合，從而使NF-κB失去活性，抑制腫瘤生長及減少新生血管生成。所以NF-κB、IκB二者在腫瘤的形成及發(fā)展過程中具有舉足輕重的作用。

本實驗通過檢測荷瘤小鼠脾細胞NF-κB及IκB的表達發(fā)現(xiàn)，荷瘤空白對照組中NF-κB表達量最高，而IκB表達量最低，隨著KGM用藥濃度的增加，NF-κB的表達量逐漸降低，IκB的表達則逐漸上升，雖然三個KGM給藥組之間并無顯著性差異（P＞0.05），但仍具有一定的量效關系。故我們認為，KGM的抗腫瘤作用也可能是通過下調NF-κB并且上調IκB的表達，或者穩(wěn)定IκB的活性、抑制了VEGF的表達，從而抑制了腫瘤新生血管的生成，進而抑制了腫瘤的增殖及轉移來實現(xiàn)的。所以，KGM的抗腫瘤機制仍需要進一步的深入探討。