苦黃栓的制備與刺激性評價

韓潤萍，劉志東，皮佳鑫，王舒雅，劉博纓，常夢春

（1.天津中醫(yī)藥大學天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培訓基地，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程研究中心，天津 301617）

陰道炎是一種很常見的婦科疾病，分為霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、細菌性陰道炎（非特異性陰道炎），常見癥狀為白帶增多，陰道灼熱瘙癢等，嚴重影響著女性的身心健康[1]。如果不能及時治療，會導致以下危害：影響夫妻生活，造成不孕，誘發(fā)宮頸糜爛，甚至引起宮頸癌惡疾，影響胎兒發(fā)育等[2]。從中醫(yī)角度看，陰道炎的發(fā)病機制在于肝腎陰虛，肝郁氣滯，濕熱下注[3]。除此之外，不良習慣或過度清潔，免疫力低下和絕經(jīng)后內(nèi)分泌失調(diào)等因素也可引發(fā)陰道炎。中醫(yī)治療陰道炎以驅(qū)除濕熱之邪為主[4]?？帱S栓處方由苦參，兒茶，黃柏，紫草及冰片組成?？鄥⒂幸志饔?，可殺死陰道滴蟲，對濕熱下注及帶下色黃效果明顯；兒茶有活血散瘀、生肌止血、收濕的功效；黃柏有清熱燥濕、瀉火解毒及抑菌的功效；紫草有抑菌消炎、活血解毒的作用；冰片有清熱止痛、消腫解毒的作用。本課題組擬制備中藥婦科栓劑苦黃栓，并考察其陰道給藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 初成年SD大鼠，雌性，體質(zhì)量（180～200）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號SCXK（京）2009-0004。

1.2 儀器 JA2103N千分之一電子天平（上海民橋），加熱磁力攪拌（德國IKA集團），RBY-4融變時限檢查儀（天津藥典標準儀器廠），美國Millipore去離子水機。

1.3 藥品與試劑 聚氧乙烯（40）單硬脂酸酯（南京威爾化工有限公司），聚乙二醇1500（南京威爾化工有限公司），聚乙二醇1000（南京威爾化工有限公司），SUPPOCIRENAS50（上海嘉法獅貿(mào)易有限公司提供），SUPPOCIRE BS2X（上海嘉法獅貿(mào)易有限公司提供）；混合藥粉（藥廠提供），冰片（藥廠提供），乙酸乙酯（分析純），兒茶素標準品（中國食品藥品檢定研究院，其量以97.2%計，批號110877-201203），兒茶對照藥材（中國藥品生物制品檢定研究院，批號121397-200401），甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純），三氯甲烷（天津市江天化工技術有限公司，分析純），甲酸（天津市化學制劑批發(fā)公司，分析純），去離子水，生理鹽水（中國大冢制藥有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 苦黃栓的制備工藝 加熱基質(zhì)（80℃）至完全融化，于50℃，以600 r/min的轉速攪拌約5 min；加入已混勻的藥粉，于50℃，以600 r/min的轉速攪拌5 min至均勻；再加入研細且過80目篩的冰片粉，于50℃，常壓條件下，以600 r/min的轉速攪拌5 min至均勻；注模，室溫冷卻。

1.4.2 苦黃栓的基質(zhì)篩選 考察的油溶性基質(zhì)有SUPPOCIRE NAS50、SUPPOCIRE BS2X?？疾斓乃苄曰|(zhì)有聚氧乙烯（40）單硬脂酸酯（S40）、聚乙二醇1500（PEG 1500）及聚乙二醇1000（PEG 1000）。分別采用油溶性基質(zhì)與水溶性基質(zhì)制備苦黃栓，以制備外觀光滑完整，色澤均勻，硬度適宜，融變時限符合中國藥典規(guī)定的苦黃栓。

栓劑的硬度評分等級：--（軟）；-（較軟）；0（適中）；+（較硬）；++（硬）。

1.4.3 兒茶的薄層色譜鑒別 取苦黃栓2粒，置具塞錐形瓶內(nèi)，在90℃水浴中加熱融化，取出，趁熱加入乙酸乙酯100 mL，充分振搖，放冷，置4℃的冰箱內(nèi)20 min，取出，濾過，于5 mL濾液內(nèi)加入2 mL去離子水，上層液作為供試品溶液。稱取兒茶素標準品，加入甲醇，制成每1 mL含有2 mg的溶液，作為標準品溶液。稱取兒茶對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，浸漬20 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。吸取上述供試品溶液、標準品溶液及對照藥材溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（20∶5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰[5]。

1.4.4 SUPPOCIRE NAS50基質(zhì)苦黃栓的大鼠陰道黏膜刺激性研究 健康的SD雌性大鼠40只，按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組10只，分別為空白組（不給藥）、低劑量組[30 mg/（只·次）]、中劑量組[60 mg/（只·次）]及高劑量組[120 mg/（只·次）]，連續(xù)給藥7 d，每日2次。每日觀察并記錄大鼠狀態(tài)、陰道及外陰是否有充血、紅斑或水腫和分泌物等情況，第8天處死，分離陰道組織，肉眼觀察陰道黏膜是否有紅腫、破潰、出血及分泌物等情況，10%甲醛溶液固定陰道樣本，脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下進行病理學檢查及分析[8-10]。

1.4.4.1 病理切片評價標準 根據(jù)黏膜層鱗狀上皮、角化層的完整性，基底細胞的狀態(tài)及炎癥細胞的浸潤情況進行評價。

0級：低倍鏡下黏膜層鱗狀上皮及角化層完整清晰，基底細胞未見增生；高倍鏡下黏膜層未見或偶見1～2個炎癥細胞，黏膜下見少量炎癥細胞浸潤。

1級：低倍鏡下黏膜層鱗狀上皮及角化層基本完整，＜1/3區(qū)域角化層變薄或基底細胞呈增生狀態(tài)；高倍鏡下黏膜層可見3～8個炎癥細胞，黏膜下見少量炎癥細胞浸潤。

2級：低倍鏡下黏膜層鱗狀上皮及角化層連續(xù)性較好，＞1/3區(qū)域角化層變薄、缺失或基底細胞呈增生狀態(tài)；高倍鏡黏膜層可見較多（8～20個）炎癥細胞或黏膜層變薄，黏膜下見較多炎癥細胞浸潤。

3級：低倍鏡下黏膜層鱗狀上皮及角化層連續(xù)性較差，＜1/3區(qū)域角化層缺失及表皮脫落壞死；高倍鏡下黏膜層可見大量（＞20個）炎癥細胞浸潤，黏膜上皮細胞壞死脫落，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤。

4級：低倍鏡下黏膜層鱗狀上皮及角化層連續(xù)性差，＞1/3區(qū)域角化層缺失及表皮脫落壞死；高倍鏡下黏膜層見大量（＞20個）炎癥細胞浸潤，黏膜上皮細胞壞死脫落，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤。

1.4.4.2 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，Kruskal-Wallis H秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 基質(zhì)的篩選 分別選擇SUPPOCIRE NAS50、SUPPOCIREBS2X及聚氧乙烯（40）單硬脂酸酯（S40）、聚乙二醇1 500、聚乙二醇1 000為基質(zhì)時，所制栓劑的評價結果見表1。

由表1可知，選用SUPPOCIRE為苦黃栓的基質(zhì)時，栓劑偏硬，融變時限符合藥典規(guī)定。當選用聚氧乙烯（40）單硬脂酸酯（S40）為基質(zhì)時，栓劑較軟，融變時限偏長；選用PEG 1500為基質(zhì)時，栓劑硬度適中，融變時限偏長；選用PEG 1000為基質(zhì)時，栓劑軟，融變時限短。綜合考慮，采用SUPPOCIRENAS50作為苦黃栓的基質(zhì)。

2.2 兒茶的薄層色譜鑒別 為初步建立苦黃栓的質(zhì)量標準，進行了兒茶的薄層色譜鑒別。在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。見圖1。

2.3 大鼠陰道黏膜刺激性實驗

2.3.1 解剖前后直觀結果 連續(xù)給藥3 d后，每天第2次給藥時，可發(fā)現(xiàn)高劑量組部分大鼠有少量藥栓殘留；連續(xù)給藥7 d期間，除上述情況外，未見充血、紅斑或水腫現(xiàn)象。

表1 苦黃栓的評價結果

第8天解剖取材，可見，高劑量組大鼠出現(xiàn)微量藥物殘留3例，腔道發(fā)干2例；中劑量組出現(xiàn)腔道發(fā)干1例；未見紅腫、破潰、出血現(xiàn)象。

2.3.2 病理切片分析

2.3.2.1 顯微鏡下分析 空白組：黏膜層細胞結構清晰完整，未見明顯炎癥細胞浸潤。低劑量組：黏膜層細胞形態(tài)結構正常，未見明顯異常。中劑量組：黏膜層結構完整清晰，細胞形態(tài)結構正常，未見明顯炎癥細胞浸潤。高劑量組：黏膜層結構較完整，但局部散在點狀上皮細胞脫落。見圖2。

圖2 大鼠陰道病理切片顯微鏡（HE，×400）

2.3.2.2 病理切片評級 按“1.4.3.1”項下的方法進行評級分析，結果見表2。

2.3.2.3 統(tǒng)計學分析 4組大鼠陰道病理切片評級結果差異性比較，采用非參數(shù)檢驗，得到χ2=0.337，P>0.05，無統(tǒng)計學差異。

表2 各組大鼠陰道病理切片評級結果

統(tǒng)計學分析中，各組兩兩比較的P值見表3。P值均大于0.05，表示各組間無統(tǒng)計學差異。

表3 各組兩兩比較的P值

3 討論

陰道給藥有見效快、療效好、生物利用度高和不良作用少的優(yōu)點[9]，是一種非創(chuàng)傷治療方式。臨床上多采用西藥栓劑為陰道炎患者治療，雖可以得到良好效果，但很難從根本上治愈病癥[10]。長期使用的患者容易對藥物產(chǎn)生耐藥性或依賴性[11]，使得病情反復發(fā)作，且可引發(fā)嚴重的陰道炎并發(fā)癥，重者導致陰道內(nèi)菌群失衡，較大影響女性患者的生活質(zhì)量和身體健康[12]。純中藥制劑苦黃栓具有清熱解毒，燥濕殺蟲及生肌之功效，其作用溫和，直接作用于病患處，針對性強，對機體內(nèi)環(huán)境干擾少，可用于陰道炎的治療。

基質(zhì)賦予栓劑外形，對制劑中藥物的釋放和吸收有一定的影響[13]。馬慧平等[14]研究了3種不同基質(zhì)苯巴比妥栓劑的藥物動力學，結果有顯著性差異。筆者采用SUPPOCIRENAS50作為基質(zhì)以制備苦黃栓，將進一步研究其動物體內(nèi)的藥物動力學。

除藥效之外，陰道給藥藥物的刺激性試驗受到了越來越多的重視[15-16]。本實驗中，各給藥組大鼠陰道均無紅腫，破潰及出血現(xiàn)象；解剖后，高劑量組大鼠有微量藥物殘留現(xiàn)象，無其他異常；低倍及高倍鏡下觀察病理切片，各組大鼠陰道黏膜層結構完整清晰，細胞形態(tài)正常，未見明顯炎癥細胞浸潤，統(tǒng)計學分析表明，給藥組與空白組之間無顯著差異。以上可得，苦黃栓為純中藥制劑，對大鼠陰道黏膜無明顯刺激性，安全性較好，其臨床藥效待進一步研究。