楊玉雙 覃碧 甘霖

摘 要 為探索EMS處理對(duì)橡膠草種子萌發(fā)的影響，確定EMS誘變橡膠草種子的最適宜條件。本研究以橡膠草品系CXCH為材料，EMS為誘變劑，采用4個(gè)EMS處理濃度（0.10%、0.20%、0.30%和0.40%），3個(gè)處理時(shí)間（4、8和12 h），分別對(duì)誘變后的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、成苗率和相對(duì)成苗率進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，EMS誘變處理不能顯著抑制橡膠草種子發(fā)芽率，卻能顯著降低橡膠草種子的發(fā)芽活力（發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)）和成苗情況（成苗率和相對(duì)成苗率），且EMS處理濃度對(duì)橡膠草種子的影響要大于處理時(shí)間的影響，并最終確定EMS處理濃度為0.30%、誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)為橡膠草種子最適宜誘變條件。

關(guān)鍵詞 橡膠草 ；化學(xué)誘變 ；甲基磺酸乙酯（EMS）

中圖分類號(hào) S576 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.001

Abstract In order to explore the effect of ethyl methyl sulfonate （EMS） treatment on seed germination of Taraxacum kok-saghyz Rodin （TKS） and optimize the conditions of EMS mutagenesis of TKS seeds， seeds of TKS line CXCH were treated with EMS at four EMS concentrations （0.10%， 0.20%， 0.30% and 0.40%） for 3 different durations of time （4， 8 and 12 hours） for mutagenesis. The treated seeds were germinated and cultured into seedlings， and their germination rate， germination vigor， germination index， seedling rate and relative seedling rate were analyzed. The results showed that the EMS treatment had little effect on the germination rate of TKS seeds， but had a significant inhibitive effect on germination vigor， germination index， seedling rate and relative seedling rate， and that the concentration of EMS had a higher inhibition effect on the seeds than the duration of treatment time. The seeds treated with EMS at a concentration of 0.30% for 12 hours were optimal for EMS mutagenesis.

Keywords Taraxacum kok-saghyz Rodin ； chemical mutagenesis ； ethyl methyl sulfonate （EMS）

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）為菊科（Asteraceae）蒲公英屬（Taraxacum）大角蒲公英組（Sect. Macrocornuta V. Soest ）多年生草本植物[1-2]。因其根部橡膠含量高、品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為最具發(fā)展前途的橡膠替代作物之一[3-5]。目前，橡膠草種質(zhì)資源少，含膠量偏低，且橡膠草的異交特性和遺傳復(fù)雜性使傳統(tǒng)的育種效率低下，這嚴(yán)重制約著橡膠草的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。因此，利用育種技術(shù)創(chuàng)建突變體庫(kù)，篩選優(yōu)異突變體可為橡膠草育種提供新種質(zhì)材料，推進(jìn)橡膠草種質(zhì)創(chuàng)新，而且創(chuàng)建突變體庫(kù)還可為橡膠草基因遺傳分析、基因定位與圖位克隆及基因功能分析奠定基礎(chǔ)，對(duì)于加快橡膠草育種進(jìn)程意義重大。EMS作為一種高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑，能夠誘發(fā)點(diǎn)突變，其誘變效果效率高、頻率高、范圍廣，而染色體畸變率相對(duì)較少，且多為顯性突變體，易于突變體篩選，因而被廣泛用于構(gòu)建突變體庫(kù)。目前，EMS誘變已成功應(yīng)用于擬南芥[6]、玉米[7-8]、水稻[9]、小麥[10-11]、大麥[12]、大豆[13-14]、花生[15]、甘藍(lán)[16]、番茄[17-18]等多種作物的誘變科研中。EMS誘變萌發(fā)試驗(yàn)是確定最佳EMS誘變條件的關(guān)鍵步驟[19]。科研人員分別對(duì)EMS 誘變對(duì)豆科[20-21]、十字花科[22]、茄科[23]等不同科的不同植物種子萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn) EMS誘變抑制植物種子的萌發(fā)，且隨著EMS處理濃度和時(shí)間的增加，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率等參數(shù)呈下降趨勢(shì)，并根據(jù)半致死劑量篩選獲得相應(yīng)物種最佳誘變條件。隨著橡膠草全基因組測(cè)序的完成[24]，橡膠草突變?nèi)后w構(gòu)建工作顯得尤為重要，但目前橡膠草種子的EMS誘變效應(yīng)及最佳誘變條件的篩選工作尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以橡膠草品系CXCH為材料，采用4個(gè)EMS處理濃度（0.10%、0.20%、0.30%和0.40%），3個(gè)處理時(shí)間（4、8和12 h），分別對(duì)誘變后橡膠草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、成苗率和相對(duì)成苗率進(jìn)行分析，探討了EMS誘變處理對(duì)橡膠草萌發(fā)的影響，并根據(jù)半致死劑量篩選橡膠草種子最佳EMS誘變處理?xiàng)l件，為進(jìn)一步構(gòu)建橡膠草突變體庫(kù)，篩選突變體、開(kāi)展橡膠草育種和基因功能研究提供基礎(chǔ)材料。此外，本研究也為其他作物開(kāi)展EMS誘變研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠草材料CXCH，2016年種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠草種質(zhì)資源圃，2017年初收獲種子。

1.2 方法

1.2.1 EMS處理

橡膠草種子EMS處理參照Kim等[25]的方法，并略作改動(dòng)。采用4個(gè)EMS處理濃度：0.10%，0.20%，0.30% 和 0.40%，3個(gè)處理時(shí)間：4、8和12 h。具體流程如下：挑選健康飽滿的橡膠草種子，100粒為1次重復(fù)，重復(fù)3次；將種子放入100 mL錐形瓶中，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），震蕩過(guò)夜培養(yǎng)；在通風(fēng)櫥中，棄去緩沖液，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液，加入相應(yīng)量的EMS（Sigma公司），室溫下震蕩培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間；結(jié)束后，棄去EMS溶液，用40 mL蒸餾水清洗20次，最后一次清洗使種子在水中浸泡1 h；清洗后，將種子轉(zhuǎn)入帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，放入26℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。

1.2.2 發(fā)芽相關(guān)指數(shù)測(cè)定

發(fā)芽率和成苗率測(cè)定：EMS誘變處理后，將各組種子分別放入帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，26 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。每天觀察和記錄種子發(fā)芽數(shù)量，以種子露白2 mm為標(biāo)準(zhǔn)，共催芽6 d，隨后將種子播種于種質(zhì)圃培養(yǎng)缽中，每天觀察和記錄出苗情況，28天以后計(jì)算成苗率和相對(duì)成苗率。

發(fā)芽率﹑發(fā)芽勢(shì)﹑發(fā)芽指數(shù)﹑成苗率和相對(duì)成苗率的計(jì)算方法：

發(fā)芽率=（種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

發(fā)芽勢(shì)=（發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，其中Gt為在不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽日數(shù)

成苗率=（成活苗總數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；

相對(duì)成苗率=（處理的成苗率/對(duì)照成苗率）×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用使用IBM SPSS Statistics 19 （IBM， New York， USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理﹑方差分析及LSD多重比較等，使用Microsoft office 2013進(jìn)行圖表制作，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（means±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)橡膠草種子發(fā)芽率的影響

由表1可知，同一處理時(shí)間下，各處理與對(duì)照相比，其發(fā)芽率隨著處理濃度增加存在不同程度下降，但差異均未達(dá)到顯著水平。同一EMS濃度下，不同處理時(shí)間的發(fā)芽率存在差異，其中，0.3%和0.4%處理12 h時(shí)發(fā)芽率都會(huì)有輕微下降，但差異也均不顯著；可見(jiàn)，0%～0.4%的EMS處理濃度不會(huì)顯著抑制橡膠草種子的發(fā)芽率（表2）。

2.2 EMS處理對(duì)橡膠草種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的影響

發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)可體現(xiàn)橡膠草種子的發(fā)芽活力。同一EMS處理時(shí)間下（表1），橡膠草種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)隨著EMS處理濃度增加而降低，且兩個(gè)參數(shù)的變化趨勢(shì)一致。當(dāng)EMS處理濃度≥ 0.30%時(shí)，各處理濃度的種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照相比均達(dá)到顯著水平（p<0.05），其中，0.4% EMS處理12 h的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)下降顯著程度達(dá)到p<0.01水平。當(dāng)EMS處理濃度≤0.10%時(shí)，各處理與對(duì)照相比差異不顯著。

同一EMS處理濃度下（表2），橡膠草種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)隨著處理時(shí)間增加均有不同程度降低，但除EMS 0.40%時(shí)，8、12與4 h處理之間的差異達(dá)到顯著水平（p<0.05）外，其余處理間的差異均未達(dá)到顯著水平。

可見(jiàn)，EMS處理濃度和處理時(shí)間均不同程度降低橡膠草種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，其中，EMS處理濃度對(duì)其的影響要大于處理時(shí)間的影響。

2.3 EMS處理對(duì)橡膠草成苗率和相對(duì)成苗率的影響

同一處理時(shí)間下（表1），橡膠草種子的成苗率隨著EMS處理濃度的增加而呈現(xiàn)不同程度下降。當(dāng)EMS處理濃度≥0.20%，處理時(shí)間≥8 h時(shí)，各處理的出苗率均顯著低于對(duì)照（p<0.05），當(dāng)EMS處理濃度≤0.10%時(shí)，各處理的成苗率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。當(dāng)處理時(shí)間為4 h時(shí)，各處理對(duì)橡膠草種子的出苗率影響最小，除EMS 0.40%時(shí)差異顯著外（p<0.05），其余濃度處理與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異。相對(duì)成苗率也表現(xiàn)出相似規(guī)律，當(dāng)EMS處理濃度≥0.10 %，處理時(shí)間≥8 h時(shí)，各處理的相對(duì)出苗率均顯著低于對(duì)照（p<0.05），當(dāng)處理時(shí)間為4 h時(shí)，各濃度處理與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異。

同一處理濃度下（表2），成苗率和相對(duì)成苗率隨著處理時(shí)間增加也均呈現(xiàn)不同的下降趨勢(shì)。當(dāng)成苗率和相對(duì)成苗率的EMS處理濃度分別≥0.30 %和≥0.20 %時(shí)，8、12與4 h處理之間的差異才達(dá)到顯著水平（p<0.05），其余處理間的差異均未達(dá)到顯著水平。

可見(jiàn)，EMS處理濃度和處理時(shí)間均不同程度影響橡膠草種子的成苗率和相對(duì)成苗率，其中，EMS處理濃度對(duì)其的影響要大于處理時(shí)間的影響。當(dāng)0.30% EMS處理12 h時(shí)，橡膠草的成苗率為26.67%，相對(duì)成苗率為50.75%，最接近半致死劑量。因此，此組合可確定為橡膠草種子EMS誘變的最適宜劑量組合。

2.4 發(fā)芽相關(guān)參數(shù)與成苗率相關(guān)性分析

由表3可知，除發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的相關(guān)性不顯著外，其余參數(shù)間相關(guān)性系數(shù)均達(dá)到顯著水平（p<0.05）。其中，發(fā)芽勢(shì)與成苗率和相對(duì)成苗率的相關(guān)性最高，分別為0.92和0.96（p<0.01）；發(fā)芽指數(shù)次之，分別為0.88和0.94（p<0.01）；發(fā)芽率最低，分別為0.63和0.52（p<0.05）?？梢?jiàn)，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)更能體現(xiàn)EMS處理后橡膠草種子的最終成苗情況。

3 討論與結(jié)論

EMS處理可抑制種子的萌發(fā)，大量研究顯示，隨著EMS處理濃度和處理時(shí)間的增加，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)等參數(shù)呈下降趨勢(shì)[26]。本研究顯示，EMS對(duì)橡膠草種子的發(fā)芽率具有一定抑制作用，但作用并不顯著，各處理發(fā)芽率與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異。這與西瓜和金花菜種子[27-28]等許多研究結(jié)果存在差異，進(jìn)一步印證了不同物種對(duì)EMS的敏感性和誘變反應(yīng)是存在差異的[29]。誘變處理濃度和處理時(shí)間對(duì)橡膠草種子的發(fā)芽活力具有抑制作用，其發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)隨著EMS處理濃度和時(shí)間的增加而逐漸降低，當(dāng)EMS濃度為0.40%，處理時(shí)間為12 h時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照相比分別降低了45.57%和37.85%；其中，EMS處理濃度對(duì)橡膠草種子發(fā)芽活力抑制效應(yīng)比處理時(shí)間更為明顯，這與Liu和刑飛等[28， 30]的研究結(jié)果一致。

EMS誘變顯著影響橡膠草種子的成苗率，EMS處理濃度和處理時(shí)間越高，橡膠草種子的成苗率和相對(duì)成苗率越低，且處理濃度對(duì)成苗的影響要大于處理時(shí)間。其中，0.40% EMS處理12 h的種子成苗率和相對(duì)成苗率分別只有12.67%和23.97%。這與王學(xué)征等[31]的研究結(jié)果一致。

EMS作為構(gòu)建突變體育種的重要手段，誘變條件選擇最為關(guān)鍵[19]。本研究顯示（表1），橡膠草種子各處理的發(fā)芽率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而且發(fā)芽率和成苗率存在很大差異，此外相關(guān)性分析顯示（表3），發(fā)芽率與成苗率和相對(duì)成苗率的相關(guān)性系數(shù)是幾個(gè)參數(shù)中數(shù)值最低，分別只有0.63和0.52?？梢?jiàn)，橡膠草用發(fā)芽率來(lái)推測(cè)EMS誘變半致死劑量是不準(zhǔn)確的。因此，本研究依據(jù)成苗率和相對(duì)成苗率數(shù)據(jù)，基于橡膠草種子的半致死劑量[32]，篩選最適宜誘變條件。

本試驗(yàn)采用4個(gè)EMS處理濃度（0.10%、0.20%、0.30%和0.40%）和3個(gè)處理時(shí)間（4、8和12 h）組合，通過(guò)對(duì)橡膠草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、成苗率和相對(duì)成苗率進(jìn)行綜合分析，確定最適宜EMS處理?xiàng)l件。結(jié)果顯示，0.30% EMS處理12 h 的相對(duì)成苗率為50.75%，為最適宜EMS誘變條件。

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