孫杰 宋鑫 王健

（上海市健康醫(yī)學(xué)院附屬浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海 201200）

骨質(zhì)疏松是多種原因引起的一組骨病，使骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加，絕經(jīng)后的婦女尤其容易患骨質(zhì)疏松癥，雌激素缺乏被認(rèn)為是導(dǎo)致這種疾病的主要原因［1］。使用雌激素替代療法（ERT）對(duì)防止或延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生具有較好的效果［2］。同時(shí)研究提示，使用ERT可以增加絕經(jīng)后婦女患心血管疾病、卵巢癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［3-5］。因此，尋找預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的替代方法值得探索。中國(guó)的草藥用于治療骨折和關(guān)節(jié)疾病已經(jīng)有數(shù)千年的歷史。淫羊藿是治療骨質(zhì)疏松癥最常用的草藥之一，具有“強(qiáng)腎”的功能［6］。中國(guó)的許多科學(xué)家先前的研究已經(jīng)反復(fù)證明，淫羊藿提取物可以減少卵巢切除大鼠模型以及老化或其他大鼠模型中的骨質(zhì)流失，但其作用機(jī)制還不清楚［7］。研究提示，Notch信號(hào)通路通過抑制成骨細(xì)胞分化，抑制骨原細(xì)胞分化，同時(shí)抑制原發(fā)性骨髓基質(zhì)細(xì)胞的脂肪生成［8］。但淫羊藿提取物能否通過調(diào)控Notch信號(hào)通路來發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的作用還不清楚。因此本研究通過制作大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型，探討淫羊藿提取物對(duì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠的治療效果及Notch信號(hào)通路發(fā)揮的作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康3月齡雌性SD大鼠25只，體質(zhì)量220～240 g。SD大鼠由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）2012-0002。動(dòng)物合格證編號(hào)：2015000577866。在溫度為18～24℃、濕度為40%～70%、控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12 h/12 h）的SPF環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：淫羊藿提取物購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，棕色干粉，淫羊藿苷含量為54.56%，批號(hào)20161017。2）試劑：10%水合氯醛購(gòu)自上海山浦化工有限公司；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蛋白抽提試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Notch1、骨保護(hù)素（OPG）、RANKL酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。3）儀器：克氏針購(gòu)自上海滬江醫(yī)療器材有限公司；Norland-XR36雙能X射線骨密度儀購(gòu)自美國(guó)Norland-XR36公司；顯微CT購(gòu)自比利時(shí)SkyScan公司；HBS-1096B酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備購(gòu)自德國(guó)Leica公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)SORVALL Heraeus公司。

1.3 分組與造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常骨折組10只和骨質(zhì)疏松組15只。用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后進(jìn)行備皮消毒后，采用背部雙側(cè)去卵巢術(shù)切除雙側(cè)卵巢，正常骨折組只僅暴露腹腔，不切除卵巢，關(guān)閉傷口。術(shù)后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續(xù)使用3 d。在溫度為18～24℃、濕度為40%～70%、控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12 h/12 h）的SPF環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水。術(shù)后3月，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法從正常骨折組和骨質(zhì)疏松組各選5只大鼠處死后檢測(cè)股骨骨密度確定骨質(zhì)疏松模型制作成功。對(duì)所有大鼠制備右側(cè)股骨干中段橫行骨折模型［9］。將骨質(zhì)疏松組分為骨質(zhì)疏松骨折組和淫羊藿治療組。

1.4 干預(yù)方法 淫羊藿治療組灌胃給予濃度為110 mg/（kg·d）的淫羊藿提取物，正常骨折組和骨質(zhì)疏松骨折組給予等量0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)給予8周，心臟取血處死大鼠，取右側(cè)股骨，剔除軟組織后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo) 1）骨密度測(cè)定：用Norland-XR36雙能X射線骨密度儀對(duì)大鼠右側(cè)股骨骨密度測(cè)量。采用小物體掃描模式：掃描速度為60 mm/s、掃描寬度5.0 cm、分辨率 1.0 mm×1.0 mm、準(zhǔn)確度 0.01%。2）血清中ALP含量的測(cè)定：分離大鼠血清，根據(jù)堿性磷酸酶（ALP）試劑盒說明書（A059-2）進(jìn)行ALP含量的測(cè)定。3）1.5 micro CT掃描：骨密度測(cè)定完成后，進(jìn)行microCT掃描（掃描參數(shù)：電壓 80 kV、電流 80 μA、功率40 W、旋轉(zhuǎn)角度 360°、分辨率 21 μm、像素組合 1×1、幀平均數(shù)6）。用ZKKS-SHARP軟件進(jìn)行分析，獲得相對(duì)骨體積（BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨體積比（BV/TV）等股骨遠(yuǎn)端參數(shù)。4）病理學(xué)檢測(cè)：取骨痂組織進(jìn)行常規(guī)甲醛固定、脫鈣、脫水、包埋、切片（2.0 μm）、蘇木精-伊紅染色 （HE染色），觀察骨痂組織學(xué)特點(diǎn)。5）ELISA法檢測(cè)Notch1、OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平：取骨折端骨組織，用液氮冷凍后進(jìn)行研磨，將組織轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖液后離心取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行Notch1、OPG和RANK1蛋白含量測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用IBM SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析進(jìn)行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠骨密度和ALP水平比較 見表1。與正常骨折組比較，骨質(zhì)疏松骨折組和淫羊藿治療組大鼠骨密度顯著降低，ALP含量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，淫羊藿治療組大鼠骨密度顯著增加，ALP含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端參數(shù)的比較 見表2，圖1。Micro-CT掃描可見，正常骨折組和淫羊藿治療組骨折部位對(duì)合良好，骨重塑規(guī)則勻稱，骨質(zhì)疏松骨折組骨折端依然存在較明顯的間隙。與正常骨折組比較，骨質(zhì)疏松骨折組BV、BV/TV和Tb.Th顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），淫羊藿治療組BV、BV/TV和Tb.Th降低不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，淫羊藿治療組BV、BV/TV和Tb.Th顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨密度和ALP水平比較（x±s）

表1 各組大鼠骨密度和ALP水平比較（x±s）

與正常骨折組比較，*P＜0.05；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，△P＜0.05。下同

組 別 n 骨密度（g/cm2） ALP（U/L）正常骨折組 5 0.19±0.02 73.54±4.19骨質(zhì)疏松骨折組 5 0.15±0.01* 101.58±7.24*淫羊藿治療組 5 0.18±0.02*△ 85.10±8.43*△

表2 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端參數(shù)的比較（x±s）

表2 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端參數(shù)的比較（x±s）

組 別 n Tb.Th（μL）BV（mm3） BV/TV（%）正常骨折組 5 88.04±4.95骨質(zhì)疏松骨折組 5 72.30±5.18*60.15±4.19 58.72±3.84 44.57±4.83*54.68±5.62*淫羊藿治療組 5 85.37±7.65△58.94±7.31△ 57.67±6.28△

圖1 大鼠右側(cè)脛骨骨折處冠狀位、矢狀位與橫截面Micro-CT掃描

2.3 各組大鼠骨痂HE組織學(xué)觀察結(jié)果 見圖2。正常骨折組可見成熟骨小梁形成，處于軟骨性骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)換階段；骨質(zhì)疏松性骨折組骨痂鄰近原骨小梁細(xì)小松散，向骨性骨痂轉(zhuǎn)化過程明顯延遲；淫羊藿治療組形態(tài)介于正常骨折組和骨質(zhì)疏松性骨折組之間。

圖2各組大鼠骨痂組織學(xué)觀察結(jié)果（HE染色，100倍）

2.4 各組骨組織中Notch1、OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平比較 見表3。與正常骨折組比較，骨質(zhì)疏松骨折組和淫羊藿治療組Notch1和OPG顯著降低，RANKL顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，淫羊藿治療組Notch1和OPG顯著增高，RANKL顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組骨組織中Notch1、OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，x±s）

表3 各組骨組織中Notch1、OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，x±s）

組別 n RANK1 Notch1 OPG正常骨折組 5 2.54±0.17骨質(zhì)疏松骨折組 5 4.33±0.56 2.68±0.21 1.83±0.13 0.84±0.06* 0.90±0.05淫羊藿治療組 5 2.82±0.40 1.69±40.09 1.54±0.11

3 討 論

目前，抗骨質(zhì)疏松藥物的研究主要在抑制骨吸收（雌激素、降鈣素、雷洛昔芬）和刺激骨形成（氟化物、合成代謝類固醇）［10］。其中，ERT是一種流行的預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的方法，但潛在風(fēng)險(xiǎn)較高。植物雌激素具有與內(nèi)源性雌激素相似的結(jié)構(gòu)和生物活性，體外和動(dòng)物研究的證據(jù)表明，植物雌激素不僅在與雌激素受體結(jié)合方面與雌激素競(jìng)爭(zhēng)，而且具有弱雌激素或抗雌激素活性［11］。動(dòng)物和人類研究表明，攝入植物雌激素可以降低乳腺癌的發(fā)病率［12］。淫羊藿廣泛用于骨病治療，黃酮類化合物是其主要的有效成分，可能通過雌激素受體發(fā)揮雌激素樣作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞無增生性作用［13］。淫羊藿作為治療骨質(zhì)疏松癥的替代療法在國(guó)際上未被廣泛接受，原因是對(duì)其作用機(jī)制和未知的活性成分缺乏明確的認(rèn)識(shí)。本研究通過評(píng)價(jià)淫羊藿提取物對(duì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠愈合過程的作用發(fā)現(xiàn)，口服淫羊藿提取物8周后，可以減低血清ALP的活性，使骨密度增加，促進(jìn)骨形成，這些骨保護(hù)作用與其他研究報(bào)道的ERT的骨保護(hù)作用相似。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了淫羊藿提取物對(duì)Notch信號(hào)通路的影響。Notch具有Notch1-4 4個(gè)受體，存在高度的結(jié)構(gòu)同源性，其中Notch1可能是所有4個(gè)Notch受體的主要功能［14］。在體內(nèi)和體外的成骨細(xì)胞中以及在骨再生過程中檢測(cè)到Notch1的表達(dá)，通過抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟來增加其活性，促進(jìn)骨礦物質(zhì)沉積［15］。RANKL和OPG是骨吸收的關(guān)鍵調(diào)控因子，直接作用于破骨細(xì)胞。RANKL已被確認(rèn)為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和骨吸收［16］。成骨細(xì)胞產(chǎn)生的OPG對(duì)于巨噬細(xì)胞-破骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞生存是必需的，OPG可以競(jìng)爭(zhēng)性RANKL，使破骨細(xì)胞的生產(chǎn)減少，RANKL/OPG濃度比例決定了破骨細(xì)胞分化、成熟及功能，并最終影響骨密度、強(qiáng)度和重建［17-18］。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿提取物能提高Notch1和OPG表達(dá)，降低RANKL表達(dá)。然而，在明確了淫羊藿提取物對(duì)骨質(zhì)疏松治療效果后，為了使國(guó)際科學(xué)界對(duì)淫羊藿提取物作為骨病治療的替代方案認(rèn)可，還需要更多的研究來確定淫羊藿提取物的活性成分以及在體內(nèi)介導(dǎo)的作用機(jī)制。

綜上所述，淫羊藿提取物對(duì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠具有較好的治療作用，其機(jī)制可能與淫羊藿提取物能抑制ALP的活力、提高Notch1、OPG表達(dá)、抑制RANKL的表達(dá)、促進(jìn)骨形成，提高骨密度有關(guān)。然而，為了淫羊藿提取物作為骨病治療的替代方案得到國(guó)際的認(rèn)可，還需確定HEP提取物的活性成分及作用的機(jī)制。