朱洪靜 李揚(yáng) 孫王男 姜國(guó)勝 周飛 姜紅

【摘 要】目的：在建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP法檢測(cè)M2型急性髓系白血病AML1-ETO融合基因，為臨床提供檢測(cè)微小殘留?。∕RD）方法。方法：設(shè)計(jì)多組引物，篩選并建立LAMP法。同時(shí)，將外引物F3、B3作為PCR引物用于PCR方法，比較分析LAMP方法的特異性和敏感性。進(jìn)行M2型白血病病例微小殘留病的檢測(cè)和驗(yàn)證。結(jié)果：與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法比較，LAMP法檢測(cè)AML1-ETO融合基因可以在特殊的等溫環(huán)境中短期實(shí)現(xiàn)，敏感度達(dá)到0.002 ng/μl，高于傳統(tǒng)PCR方法。具有快速判斷結(jié)果的特點(diǎn)。具有較高的臨床吻合性、特異性和敏感性。結(jié)論：LAMP可以成為傳統(tǒng)RT-PCR和熒光定量PCR的替代方法。

【關(guān)鍵詞】白血病;微小殘留病;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法;融合基因

Abstract Objective： To establish a loop-mediated isothermal amplification of LAMP for detection of AML1-ETO fusion gene and to perform rapid detection of minimal residual disease in AML M2 patients.Methods： Log into the NCBI online software to design multiple sets of LAMP primers and design the PCR primers required for the validation phase. According to the reaction time and specificity， the reaction progress and results of different LAMP primer sets were detected and screened. According to the same nucleic acid sequence， PCR primers were designed to detect the gene expression， and the naked eye was observed for the positivity of the amplification results according to the color change of the reaction solution. At the same time， the external primers F3 and B3 were used as PCR primers for the comparison of the LAMP method and the PCR method to analyze the specificity and sensitivity of the LAMP method. Some clinical cases were selected for the corresponding inspection and analysis of minimal residual disease.RESULTS： The temperature of the AML1-ETO fusion gene was not changed by the LAMP assay. The whole process of the denaturation step could be completed in a short time under isothermal conditions. The amplified product could be detected or the amplification reaction could be judged. The LAMP method does not require special reagents， and the amplification does not require changing the reaction temperature to quickly determine the characteristics of the results. It has a high agreement with the traditional PCR detection method.Conclusion： The detection of AML1-ETO fusion gene by LAMP method has high specificity and sensitivity. It is an alternative method to traditional RT-PCR and fluorescence quantitative PCR.

Key words： leukemia; minimal residual disease; loop-mediated isothermal amplification; AML1-ETO fusion gene.

【中圖分類號(hào)】 R387.22

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A【文章編號(hào)】 1672-3783（2019）04-03-077-01

前言

多數(shù)研究結(jié)果表明，這種白血病復(fù)發(fā)的原因和微小殘留?。╩inimal? residual disease MRD）有關(guān)[1-3]。臨床常用的AML的MRD檢測(cè)技術(shù)主要包括染色體分析、FISH技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、數(shù)字化PCR＼＼多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)和二代測(cè)序等，但是多數(shù)步驟繁瑣，并各自存在不同的缺點(diǎn)。如RT-PCR或者RQ-PCR等PCR方法，檢測(cè)步驟多，需要時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)條件要求高。因此，需要發(fā)掘新的快速、準(zhǔn)確、敏感和穩(wěn)定的檢測(cè)方法。LAMP法是“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification， LAMP），是一種“簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確”的基因擴(kuò)增方法。本研究采用LAMP法檢測(cè)AML1-ETO融合基因，具有較高的特異性、敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要材料：RPMI Medium 1640購(gòu)自Hyclone公司，血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞株來(lái)源：K562細(xì)胞、NB4細(xì)胞、kasumi-1細(xì)胞、HL-60細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。引物：由博尚公司合成。

1.2 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)：首先將外引物F3、B3作為PCR引物，采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中AML1/ETO基因的表達(dá)。

1.3 LAMP引物設(shè)計(jì)與篩選：登錄NCBI查閱目的基因的保守基因序列，設(shè)計(jì)多組LAMP引物，并設(shè)計(jì)驗(yàn)證階段所需的PCR引物。優(yōu)化擴(kuò)增條件，LAMP檢測(cè)方法。檢測(cè)特異性、敏感性和穩(wěn)定性。

1.4 臨床樣本檢測(cè)：用建立的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)15份臨床樣本，與PCR法進(jìn)行對(duì)比，比較陽(yáng)性率、臨床符合率、操作時(shí)間、操作便捷度，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的先進(jìn)性和臨床可應(yīng)用性。

2 結(jié)果

2.1 LAMP方法的建立及引物篩選：擴(kuò)增條件為60-65℃恒溫反應(yīng)1 h;LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中擴(kuò)增條件為：63℃恒溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，取出離心管，裸眼觀察結(jié)果。若管中液體變?yōu)榫G色，則為陽(yáng)性，若為橙色則為陰性（如圖1）。

2.2 敏感性：LAMP檢測(cè)：0.002-2000 ng/μl的樣本RNA，0.002-2000 ng/μl的樣本均為陽(yáng)性，反應(yīng)結(jié)束后均變?yōu)榫G色，0.0002 ng/μl的樣本為陰性。表明LAMP方法對(duì)AML1/ETO基因的檢測(cè)下限為0.002 ng/μl。以F3、B3為引物，對(duì)以上樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示樣本PCR方法對(duì)AML1/ETO基因的檢測(cè)下限為0.02 ng/μl 。說(shuō)明LAMP方法比PCR方法的靈敏度高10倍。

2.3臨床樣本檢測(cè)：選擇正常人血液15例、RT-PCR陽(yáng)性的AML-M2型患者血液15例，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。來(lái)自15例M2患者為陽(yáng)性結(jié)果，正確率100%，表明本試劑盒特異性很好。

3 討論

隨著對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的深入研究及治療方案的改進(jìn)，白血病的診治水平不斷提高，但仍有部分患者最終復(fù)發(fā)，甚至導(dǎo)致死亡[3]。復(fù)發(fā)的主要原因是存在微小殘留?。∕RD）。本研究利用LAMP檢測(cè)白血病患者常見(jiàn)的AML1/ETO融合基因，擬建立白血病微小殘留病快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明我們建立的LAMP檢測(cè)方法的敏感度達(dá)到0.002ng/μl，而傳統(tǒng)PCR方法的敏感性為0.02ng/μl。該檢測(cè)方法在臨床病例檢測(cè)中也得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，是臨床急需發(fā)展的快速M(fèi)RD檢測(cè)方法。

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