趙君雅 李威 李薇 孫鴻宇 李欣 官杰

[摘要] 目的 探討白介素-17（IL-17）、IL-35在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠腸黏膜中的表達(dá)水平及意義。 方法 健康的SD雄性大鼠65只，分為對(duì)照組（n = 12）和實(shí)驗(yàn)組（n = 53）。對(duì)照組不處理，于實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選取12只SD大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選最合適劑量的2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）造模劑構(gòu)建UC動(dòng)物模型。大鼠進(jìn)行正式造模，通過(guò)每日觀察體重及一般情況（精神狀態(tài)，糞便形狀、顏色等）的改變，依據(jù)疾病活動(dòng)度（DAI）評(píng)分。剩余大鼠分別于第3、7、14天處死，并結(jié)合潰瘍程度分為A、B、C組，每組各12只（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡5只）。使用結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）對(duì)結(jié)腸評(píng)分，判斷潰瘍程度，采用ELISA法檢測(cè)腸黏膜中白細(xì)胞介素-17（IL-17）、IL-35的含量指標(biāo)，同時(shí)評(píng)估結(jié)腸病理改變。綜合得出IL-17與IL-35的含量與潰瘍程度的關(guān)系。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組DAI、CMDI分?jǐn)?shù)增加，結(jié)腸組織的病理情況鏡下改變顯著（P < 0.05）。各組大鼠腸黏膜組織中IL-17水平隨著潰瘍程度加重明顯升高，IL-35水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞因子作為炎癥介質(zhì)起到重要作用，IL-17含量與炎性反應(yīng)呈正相關(guān)，可能促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生，而IL-35含量與炎癥程度呈負(fù)相關(guān)，可能抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 潰瘍性結(jié)腸炎;SD大鼠;潰瘍黏膜損傷指數(shù);疾病活動(dòng)度;白細(xì)胞介素-17;白細(xì)胞介素-35

[中圖分類號(hào)] R574.62? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）03（c）-0015-04

[Abstract] Objective To investigate the expression level and significance of interleukin-17 （IL-17） and IL-35 in intestinal mucosa of Ulcerative colitis UC rats. Methods Six-five healthy SD male rats were divided into control group （n = 12） and experimental group （n = 53）. The blank control group was not treated， and 12 SD rats were randomly selected from the experimental group for the preliminary experiment， the most appropriate dose of TNBS （2， 4， 6-trinitrobenzenesulfonic acid） modeling agent was selected to build UC animal model. Changes in body weight and general conditions （mental status， stool shape， color， etc.） were observed daily and scored according to disease activity level （DAI） since it has been formally modeled. The rest in the control group were sacrificed on day 3， day 7 and day 14， respectively. The remaining rats were formally modeled and divided into group A ， group B and group C with 12 rats in each group according to the degree of ulcer （5 rats died accidently）. Colonic mucosa damage index （CMDI） was used to score the colon and determine the degree of ulcer. The contents of IL-17 and IL-35 in the intestinal mucosa were detected by ELISA method， and the pathological changes of the colon were evaluated at the same time. The correlation between the levels of IL-17 and IL-35 and the degree of ulcer was obtained. Results Comparison between the experimental group and the blank group， DAI score and CMDI score were increased， and the pathological changes of colon tissue in the experimental group were significant under the microscope （P < 0.05）. The level of IL-17 in the intestinal mucosa of rats in each group increased significantly with the aggravation of the ulcer， and the level of IL-35 decreased significantly， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion During the development of ulcerative colitis， cytokines play an important role as mediators of inflammation. The content of IL-17 is positively correlated with the inflammatory response and may promote the occurrence of inflammatory response， while the content of IL-35 is negatively correlated with the degree of inflammation， and may be involved in inhibiting the occurrence and development of inflammatory response.

[Key words] Ulcerative colitis;SD rats;Colonic mucosa damage;Disease activity level;IL-17;IL-35

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）以慢性非特異性炎癥為主，好發(fā)于結(jié)腸，臨床上多表現(xiàn)為腹部疼痛難忍、稀水樣便甚至癌前病變，病變區(qū)域涉及黏膜表層和黏膜下層。疾病經(jīng)久不愈、反復(fù)發(fā)作，這給患者帶來(lái)極大的痛苦。目前關(guān)于UC發(fā)病機(jī)制的研究很廣泛，但仍不能明確發(fā)病的原因。國(guó)內(nèi)外學(xué)者[1]得出較為統(tǒng)一的觀點(diǎn)，認(rèn)為在遺傳易感宿主暴露在環(huán)境危險(xiǎn)因素下（例如細(xì)菌感染而引起腸道免疫系統(tǒng)紊亂），異常的免疫反應(yīng)能引發(fā)大量炎癥細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致腸道組織受損和影響腸道消化功能。在腸道免疫反應(yīng)應(yīng)答中，細(xì)胞因子起到?jīng)Q定性作用。介導(dǎo)UC發(fā)病的細(xì)胞因子主要作用可分為促進(jìn)炎性反應(yīng)及抑制炎性反應(yīng)兩大類，例如腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素（IL）等[2]。在調(diào)控腸道免疫反應(yīng)過(guò)程中，腸黏膜區(qū)促炎因子含量升高，抑炎因子含量降低，腸黏膜病損區(qū)出現(xiàn)明顯的炎癥表現(xiàn)：局部組織出血、潰瘍，腸道損傷[3]。IL-35是由Treg細(xì)胞分泌的新型細(xì)胞因子[4]，通過(guò)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖從而抑制炎性反應(yīng)[5]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，其能促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生并協(xié)同其他炎癥介質(zhì)來(lái)增強(qiáng)炎性反應(yīng)[6]。本研究通過(guò)2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）構(gòu)建UC模型，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IL-17、IL-35在不同潰瘍程度下的含量，以此來(lái)探討其在UC發(fā)病過(guò)程中的表達(dá)及意義，在免疫學(xué)分子水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)UC的發(fā)病本質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD標(biāo)準(zhǔn)大鼠65只，體重為270～290 g（購(gòu)自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），SPF級(jí)，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：No.430047000322111，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2017-0012。飼養(yǎng)于溫度適宜、光照規(guī)律、通風(fēng)良好的環(huán)境下。

1.2 主要試劑和器材

IL-35 ELISA試劑盒（批號(hào)：CD-ELA-1580）、IL-17 ELISA試劑盒（批號(hào)：CD-ELA-3479）購(gòu)于武漢純度有限公司;TNBS試劑（批號(hào)：SLBT1675）購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;石蠟包埋機(jī)（LEICAEG1150H，德國(guó)）;切片機(jī)（LEICARM2255，德國(guó)）;臺(tái)式微型離心機(jī)（Thermo Electron Corporation，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 造模? 造模前預(yù)先禁食48 h（正常飲水）。隨機(jī)選取65只SD大鼠中12只進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。另選取12只作對(duì)照組;剩余SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行UC造模。對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，藥品為7%水合氯醛（300 mg/kg）。標(biāo)記灌胃器8 cm處作為止端刻度，并使用其將乙醇-TNBS混合溶液：TNBS液（100 mg/kg）與50%的乙醇0.25 mL從肛門灌入至結(jié)腸部位，以保證造模液精確到達(dá)預(yù)定區(qū)域。緩慢注射藥液，之后緩慢旋出灌胃器。造模大鼠采用頭低尾高姿態(tài)倒立10 min后放回籠中，注意保暖，覆蓋衛(wèi)生棉待大鼠自然清醒，仔細(xì)記錄其生理變化。自由飲食。實(shí)驗(yàn)組3 d內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、稀水膿血便的模型鼠，作為標(biāo)準(zhǔn)的UC動(dòng)物模型。

1.3.2 標(biāo)本制備? 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有5只大鼠意外死亡。隨機(jī)將剩余大鼠分為A、B、C三組，每組各12只，分別在造模后第3、7、14天將其處死。剪取肛門至盲腸末端病損嚴(yán)重的腸管，剝離腸系膜，便于肉眼觀察及進(jìn)一步病理操作。

1.3.3 觀察指標(biāo)? ①疾病活動(dòng)度（DAI）變化：參考鄭萍[7]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)數(shù)據(jù)記錄對(duì)大鼠進(jìn)行DAI評(píng)分，DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血情況分?jǐn)?shù)）/3。見表1。②結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）[8]是通過(guò)肉眼對(duì)結(jié)腸大體損傷程度的觀察進(jìn)行評(píng)分。大鼠腸管紋理清晰、黏膜平整、無(wú)皺縮、長(zhǎng)度正常;腸壁薄厚均勻，未見水腫、破損及潰瘍者記0分;大鼠腸管皺縮，腸壁略有充血，黏膜層次紊亂和/或腫脹，腸道內(nèi)有橘黃色的黏性附著物記1分;腸管皺縮明顯，黑褐色硬皮樣膜狀物附著于充血腫脹的腸道表面，易于撕脫，其下可見潰瘍的腸黏膜并有半成型稀便附著記3分;腸管縮短、僵硬，腸壁淤血情況好轉(zhuǎn)，腸道內(nèi)可見積氣及不成形稀便殘留，黏膜表面有顆粒感，見棕色膜狀物質(zhì)附著于腸道表面，其下可見明顯潰瘍記4分。③以10%的甲醛固定病損嚴(yán)重的結(jié)腸段作為標(biāo)本;經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行HE染色;應(yīng)用病理學(xué)方法觀察結(jié)腸組織[9]。④ELISA法檢測(cè)UC大鼠腸黏膜組織中的IL-17、IL-35水平。比較各組大鼠DAI、CMDI評(píng)分，以及UC大鼠腸黏膜組織中IL-17、IL-35水平含量的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAI評(píng)分

密切觀察大鼠造模后生理狀態(tài)，根據(jù)疾病活動(dòng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記錄，對(duì)照組大鼠反映靈敏，表現(xiàn)活躍，毛色光滑，進(jìn)食、排便正常。按潰瘍程度分為A組、B組、C組：A組DAI評(píng)分為輕度，對(duì)刺激表現(xiàn)不活躍，糞便不成形;B組DAI評(píng)分為重度，不活躍，毛色暗淡，身體顫抖，糞便可見肉眼黑褐色血便;C組DAI評(píng)分為中度，精神萎靡，進(jìn)食顯著減輕，但腹瀉較重度組有所緩解，大鼠表現(xiàn)有所恢復(fù)。DAI分值越高，說(shuō)明UC越嚴(yán)重，A組至B組大鼠癥狀逐漸嚴(yán)重，C組有好轉(zhuǎn)趨勢(shì)。

2.2 CMDI評(píng)分

對(duì)照組大鼠腸道無(wú)縮短，腸壁黏膜平整，紋路自然，未見腫脹、糜爛及潰瘍;A組大鼠的腸管發(fā)生皺縮，有不成形稀便殘留，腸壁嚴(yán)重充血，黏膜紊亂，可見腫脹，有橘黃色的黏性物質(zhì)附著于腸道內(nèi);B組大鼠腸管縮短、僵硬，但壁內(nèi)淤血略有好轉(zhuǎn)，顆粒狀腸黏膜表面有棕色膜狀物質(zhì)附著，其下可見明顯潰瘍;C組大鼠腸管皺縮明顯，黑褐色膜狀物附著于嚴(yán)重充血的腸壁表面，其下可見明顯的腸黏膜糜爛。CMDI評(píng)分為：對(duì)照組1分;A組 1.5分;B組 4分;C組 3分。隨造模時(shí)間變化，CMDI評(píng)分呈現(xiàn)先顯著升高后降低，提示A組至B組結(jié)腸損傷程度逐漸加重，C組損傷程度緩解。

2.3 病理分析

鏡下可見對(duì)照組大鼠腸黏膜僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰明了，杯狀細(xì)胞密集，無(wú)糜爛及潰瘍等病損表現(xiàn);A組鏡下可見黏膜下層大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腸黏膜的基本結(jié)構(gòu)消失，杯狀細(xì)胞減少，肌層變厚，隱窩結(jié)構(gòu)加深，層次混亂，腸壁水腫，可見出血灶。B組鏡下可見大量深達(dá)黏膜下層、肌層甚至漿膜層的以淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);腺上皮細(xì)胞排列紊亂，部分可見輕度增生及炎性肉芽腫。C組鏡下可見黏膜下肉芽組織形成，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)及纖維組織大量增生，部分潰瘍開始愈合?？梢砸姷?，A、B、C三組大鼠炎癥的變化由初期逐漸加重至后期趨于緩解。

2.4 各組腸黏膜IL-17、IL-35的含量比較

經(jīng)單因素方差分析，對(duì)照組、A組、B組、C組之間的IL-17、IL-35兩個(gè)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨大鼠病情由逐漸加重直至趨于恢復(fù)的過(guò)程中，A、B、C三組中的IL-17含量先升高后輕微下降、IL-35含量先下降隨后略為升高的趨勢(shì)。經(jīng)LSD檢驗(yàn)進(jìn)一步兩兩比較，對(duì)照組與A、B、C三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。A組與B、C兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），B、C兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。通過(guò)比較各實(shí)驗(yàn)組UC模型由輕到重至逐漸恢復(fù)的過(guò)程，可發(fā)現(xiàn)雖然C組大鼠腸黏膜中的IL-17含量高于A組（P < 0.05），但存在著先逐漸升高后輕微下降的變化趨勢(shì);而C組IL-35含量低于A組（P < 0.05），存在著先逐漸降低再略微升高的變化。

3 討論

炎癥性腸病發(fā)病以歐美國(guó)家患病率最高[10]，具有明顯的地域性差異。UC的發(fā)病率為9/10萬(wàn)～12/10萬(wàn)，患病率為205/10萬(wàn)～240/10萬(wàn)[11-13]。現(xiàn)有研究[14-15]表明，自身免疫反應(yīng)為該病的重要發(fā)病機(jī)制，IL-17和IL-35與UC的發(fā)病關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CMDI、DAI進(jìn)行疾病評(píng)分。與對(duì)照組比較實(shí)驗(yàn)組大鼠存在著不同程度的黏液膿血便、體重下降等癥狀，結(jié)腸損傷程度大小不一;通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組大鼠間的病情變化發(fā)現(xiàn)：第3天至第7天逐漸嚴(yán)重，約至第14天病情開始出現(xiàn)恢復(fù)跡象。

目前多數(shù)學(xué)者[16]的觀點(diǎn)認(rèn)為，IL-17主要是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生。Ulhig等[17]發(fā)現(xiàn)在重組激活基因（RAG）缺失的情況下，IL-23仍可誘導(dǎo)IL-17的表達(dá);由于RAG大鼠中缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞，說(shuō)明IL-23可能并不是T細(xì)胞產(chǎn)生的，而可能是通過(guò)誘導(dǎo)先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，這為IL-17參與先天免疫產(chǎn)生提供了證據(jù)。近年來(lái)，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的多種研究工作揭示了IL-17和IL-23在炎癥性腸病中的作用[18]，IL-17可能促進(jìn)了UC的慢性炎癥的形成過(guò)程，IL-17表達(dá)水平與UC有密切相關(guān)性。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)組大鼠UC由輕度逐漸加重至好轉(zhuǎn)的過(guò)程中，腸黏膜的IL-17水平由A組至B組顯示升高（P < 0.05），而B組至C組IL-17呈現(xiàn)少量減少，由于第14天可能為疾病好轉(zhuǎn)初期[19]，所以IL-17水平與疾病程度對(duì)應(yīng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），IL-17同病情表現(xiàn)呈正相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)與鄭紫丹等[20]的研究成果類似，進(jìn)一步證明了IL-17能促進(jìn)UC的發(fā)生和發(fā)展。

IL-35作為一種具有強(qiáng)大抗炎作用的新型細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的抗炎作用[21]。IL-35可以誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為一種具有免疫抑制介導(dǎo)作用的新型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（iTr35）[22]，對(duì)腸道免疫應(yīng)答具有重要的保護(hù)作用。依據(jù)唐文靜等[23]研究，隨著UC病情的加重，患者血清IL-35濃度隨之減少。本研究中，在UC逐漸加重至出現(xiàn)好轉(zhuǎn)的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組腸黏膜的IL-35水平從A組至B組降低（P < 0.05），B組和C組少量升高。第14天可能為疾病好轉(zhuǎn)初期，但I(xiàn)L-35升高差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），IL-35水平同病情表現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)論與唐文靜等[23]的結(jié)果類似，從而進(jìn)一步證明了IL-35的減少，可能抑制了炎癥的發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了隨著UC病情逐漸嚴(yán)重，在病損區(qū)IL-35水平逐漸升高，IL-17水平逐漸降低。通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)UC與炎性反應(yīng)密切相關(guān);通過(guò)細(xì)胞因子的定量檢測(cè)，為炎癥發(fā)展提供了確鑿的證據(jù)，這對(duì)判斷UC病情嚴(yán)重程度，提供了新的檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)可以在免疫學(xué)分子水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)UC的發(fā)病本質(zhì)。這為今后進(jìn)一步探索UC治愈方法提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2018-08-30? 本文編輯：封? ?華）