雙層HEPA采用過(guò)氧化氫消毒方式的消毒效果研究

陳 思，王 棟，孫慶印，張曉宇，杜春曉，湯國(guó)慶，周 琦

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150069）

0 引言

隨著進(jìn)出口貿(mào)易規(guī)模的日益擴(kuò)大及城市化、工業(yè)化進(jìn)程的加快，各種不確定因素引發(fā)的高致病性人畜共患傳染病全球頻發(fā)。為防范生物入侵、防止生物污染、維護(hù)國(guó)門(mén)生物安全，我國(guó)自20世紀(jì)80年代起建設(shè)高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，截至目前已建成并正式投入運(yùn)行的最高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室共2家，其中國(guó)家動(dòng)物疫病防控高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室是我國(guó)首個(gè)自主設(shè)計(jì)及建設(shè)、不受任何國(guó)外勢(shì)力控制和影響、亞洲規(guī)模最大的大動(dòng)物最高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室，僅高效空氣過(guò)濾器（high efficiency particulate air filter，HEPA）就配備 110余套，過(guò)濾器總計(jì) 267余個(gè)[1]。

針對(duì)實(shí)驗(yàn)室最重要的關(guān)鍵防護(hù)屏障——HEPA，我國(guó)頒布的GB 19489—2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》中第6.4.16條[2]和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）制定的 CNAS-CL53：2016《實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則對(duì)關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備評(píng)價(jià)的應(yīng)用說(shuō)明》中第5.7.3條[3]均指出在安裝和更換HEPA前，必須進(jìn)行徹底消毒，并對(duì)消毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

我國(guó)在空間消毒滅菌技術(shù)方面應(yīng)用最多的方式有甲醛熏蒸、臭氧、過(guò)氧化氫蒸汽滅菌等。其中，甲醛熏蒸具有劇毒、易燃、強(qiáng)腐蝕性、蒸汽引起呼吸道及眼睛等部位強(qiáng)烈不適等不足，臭氧具有對(duì)人體呼吸道黏膜有刺激性、強(qiáng)氧化性等缺點(diǎn)，且這2種方式很難殺滅6-log嗜熱脂肪芽孢桿菌。而過(guò)氧化氫蒸汽滅菌消毒后無(wú)有害物質(zhì)殘留，且滅菌效果能完全殺滅6-log嗜熱脂肪芽孢桿菌。因此，近年來(lái)大多數(shù)生物安全實(shí)驗(yàn)室采取安全、有效、環(huán)保的過(guò)氧化氫蒸汽消毒方式[4-5]。動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（ABSL-3實(shí)驗(yàn)室）的HEPA為單層過(guò)濾，動(dòng)物生物安全最高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室（ABSL-4實(shí)驗(yàn)室）的HEPA為雙層過(guò)濾。既往文獻(xiàn)[6-8]中多為過(guò)氧化氫消毒裝置對(duì)物體表面消毒效果的研究，或ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中HEPA的原位消毒措施和ABSL-4實(shí)驗(yàn)室中HEPA原位消毒的研制[9]，在實(shí)際操作時(shí)缺乏各項(xiàng)指標(biāo)作參考。因此，筆者通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，探討合適的消毒機(jī)器、最低劑量等，為我國(guó)生物安全領(lǐng)域的工作人員在消毒機(jī)的選擇及劑量控制等方面提供建議和指導(dǎo)。

1 材料與方法

本次消毒采用國(guó)外A品牌[過(guò)氧化氫蒸汽（hydrogen peroxide vapour，HPV）消毒方式]和 B 品牌[汽化過(guò)氧化氫（vaporized hydrogen peroxide，VHP）消毒方式]過(guò)氧化氫消毒機(jī)，同時(shí)對(duì)相同體積的2套雙層HEPA單元進(jìn)行消毒效果的驗(yàn)證及評(píng)估。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

消毒劑：35%的過(guò)氧化氫消毒液（廠商Bioquell，型號(hào)HPV-AQ，批號(hào)CFE5000064201705）。中和劑溶液：10 g/L硫代硫酸鈉磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15 min。消毒機(jī)：國(guó)外A品牌和B品牌過(guò)氧化氫消毒機(jī)，相關(guān)參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 兩品牌消毒機(jī)參數(shù)對(duì)照表

1.2 消毒對(duì)象

消毒對(duì)象為國(guó)家動(dòng)物疫病防控高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室設(shè)備層的2臺(tái)體積約為5 m3的箱式排風(fēng)HEPA，過(guò)濾單元為雙層過(guò)濾。HEPA購(gòu)自美國(guó)康菲爾公司，對(duì)0.3 μm氣溶膠粒子的過(guò)濾效率為99.99%。箱體進(jìn)風(fēng)口和出風(fēng)口均設(shè)有電動(dòng)氣密閥，氣密閥前端均配有消毒管道接口，可實(shí)現(xiàn)原位消毒。

1.3 消毒環(huán)境

消毒機(jī)檢測(cè)過(guò)濾單元內(nèi)部的環(huán)境溫度26℃，相對(duì)濕度10.5%。

1.4 殺菌效果鑒定

用生物指示劑Steris嗜熱脂肪芽孢桿菌（ATCC 12980）不銹鋼菌片（廠商 Steris，批號(hào) H0668）、化學(xué)指示劑Steris PCC051（Steris）。滅菌后的菌片在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)（溫度57℃）7 d。若7 d后培養(yǎng)基澄清，則滅菌合格；反之，則滅菌失敗?；瘜W(xué)指示卡滅菌后，觀察端部變色塊的顏色變化，若徹底變成黃色則消毒成功，否則消毒失敗。化學(xué)指示卡對(duì)滅菌時(shí)間和溫度要求較低，不能集中顯示滅菌情況，但可以作為生物監(jiān)測(cè)的先導(dǎo)，起參考作用。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 準(zhǔn)備階段

為驗(yàn)證消毒效果，取出HEPA按圖1所示位置放置6組生物指示劑和化學(xué)指示卡，放置位置均位于不易徹底滅菌的死角，待指示劑粘貼完成后將HEPA裝回。A品牌的實(shí)際操作現(xiàn)場(chǎng)如圖2所示，B品牌的實(shí)際操作現(xiàn)場(chǎng)如圖3所示。

圖1 生物指示劑和化學(xué)指示卡分布位置圖

圖2 A品牌消毒機(jī)消毒現(xiàn)場(chǎng)

圖3 B品牌消毒機(jī)消毒現(xiàn)場(chǎng)

1.5.2 消毒階段

確認(rèn)空調(diào)處于關(guān)閉狀態(tài)，關(guān)閉電動(dòng)氣密閥，使高效過(guò)濾單元處于密閉狀態(tài)，開(kāi)啟消毒口處蝶閥，同時(shí)啟動(dòng)A、B品牌過(guò)氧化氫消毒機(jī)。

（1）A品牌消毒機(jī)。

該消毒機(jī)的消毒過(guò)程分為準(zhǔn)備（時(shí)間至少10 min）、注入、保持和分解通風(fēng)4個(gè)階段。準(zhǔn)備階段為消毒機(jī)自檢階段；注入階段為過(guò)氧化氫的高速注入階段，使過(guò)氧化氫蒸汽體積分?jǐn)?shù)迅速升高；保持階段為高體積分?jǐn)?shù)過(guò)氧化氫蒸汽保持一定時(shí)間，期間有過(guò)氧化氫低速注入。工作人員通過(guò)調(diào)節(jié)A品牌消毒機(jī)注入和保持階段消毒液的注入速率、注入時(shí)間來(lái)完成不同條件下的滅菌效果（其他階段的參數(shù)使用消毒機(jī)自動(dòng)默認(rèn)參數(shù)，不需要修改）。對(duì)A品牌消毒機(jī)進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中各階段過(guò)氧化氫不同注入速率、持續(xù)時(shí)間及消毒液用量參數(shù)詳見(jiàn)表2。雙層HEPA結(jié)構(gòu)特殊，因此將注入、保持階段的持續(xù)時(shí)間均設(shè)為60 min，保持階段注入速率設(shè)置為1 g/min，保持過(guò)氧化氫蒸汽體積分?jǐn)?shù)不急速衰減。通過(guò)調(diào)節(jié)注入階段的注入速率，觀察雙層HEPA尾端過(guò)氧化氫蒸汽體積分?jǐn)?shù)的變化。過(guò)氧化氫蒸汽體積分?jǐn)?shù)是消毒效果的側(cè)面判斷依據(jù)。3組實(shí)驗(yàn)中各階段過(guò)氧化氫蒸汽最高體積分?jǐn)?shù)詳見(jiàn)表3。在消毒劑注入總量超過(guò)360 ml時(shí)，尾端過(guò)氧化氫蒸汽最高體積分?jǐn)?shù)幾乎不變，從而證明整體的消毒效果已達(dá)到極值。

表2 3組實(shí)驗(yàn)中各階段過(guò)氧化氫不同注入速率、持續(xù)時(shí)間及消毒液用量

表3 3組實(shí)驗(yàn)中各階段過(guò)氧化氫蒸汽最高體積分?jǐn)?shù)ppm

（2）B品牌消毒機(jī)。

該消毒機(jī)的消毒過(guò)程分為準(zhǔn)備（2 min）、注入和通風(fēng)3個(gè)階段。本次消毒設(shè)置為智能調(diào)節(jié)程序，由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境相對(duì)濕度約為10.5%，即VHP滅菌起始相對(duì)濕度為10.5%，在此條件下，將飽和度上限設(shè)為30%、下限設(shè)為25%時(shí)，才能保證汽化過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)足夠高，且不產(chǎn)生冷凝水（冷凝水會(huì)嚴(yán)重影響高效過(guò)濾芯的通透性和過(guò)氧化氫的消毒效果）。風(fēng)機(jī)以400 m3/h的流速工作，在此流速下汽化過(guò)氧化氫有較好的穿透效果。注入階段持續(xù)時(shí)間3 h，由于箱式排風(fēng)高效過(guò)濾器的體積僅為5m3，因此注入速率應(yīng)盡量小。該消毒機(jī)的注入速率為5～45 g/min，本實(shí)驗(yàn)中選擇6 g/min的注入速率，持續(xù)注入消毒液309 ml。智能調(diào)節(jié)程序下重復(fù)消毒3次，查看每次消毒結(jié)果。由于B品牌消毒機(jī)體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)口與蒸汽注入口位置較近且無(wú)分隔，而汽化過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)值 10 min 后已達(dá)到 300 ppm（1 ppm=1×10-6）以上，說(shuō)明體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)錯(cuò)誤，故無(wú)法給出各個(gè)階段體積分?jǐn)?shù)變化情況，僅能通過(guò)菌片培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)消毒效果。

2 消毒效果評(píng)價(jià)

B品牌消毒機(jī)為自動(dòng)控制程序，可根據(jù)環(huán)境情況自動(dòng)調(diào)節(jié)。為對(duì)比A、B品牌消毒機(jī)的消毒效果，應(yīng)盡量將A品牌的參數(shù)設(shè)置與B品牌參數(shù)對(duì)應(yīng)。A品牌消毒機(jī)消毒過(guò)程在注入、保持階段注入速率由1 g/min調(diào)至5 g/min，3組實(shí)驗(yàn)的分解通氣階段過(guò)氧化氫蒸汽體積分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)如圖4所示，各組實(shí)驗(yàn)在分解通風(fēng)階段的最高體積分?jǐn)?shù)為130、170和170 ppm。

圖4 A品牌3組實(shí)驗(yàn)分解通氣階段過(guò)氧化氫蒸汽體積分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)

消毒結(jié)束后，收集各點(diǎn)生物指示劑和化學(xué)指示卡。在生物安全柜內(nèi)，取10 g/L硫代硫酸鈉PBS 0.5 ml和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)液4.5 ml放入試管內(nèi)，把生物指示劑內(nèi)的不銹鋼菌片取出，放入試管內(nèi)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置1組陽(yáng)性對(duì)照組、1組陰性對(duì)照組。將試管放入恒溫培養(yǎng)箱（57℃）培養(yǎng)7 d[生物指示劑Steris嗜熱脂肪桿菌（ATCC12980）的培養(yǎng)溫度為57℃]。A、B品牌消毒機(jī)消毒效果如圖5、6所示。

圖5 A品牌消毒機(jī)消毒效果

圖6 B品牌消毒機(jī)消毒效果

實(shí)驗(yàn)證明，A品牌消毒機(jī)消毒完成后，其進(jìn)氣口端、中間端的化學(xué)指示卡完全由紅褐色變成黃色，視為合格；尾端邊緣仍存在褐色痕跡，視為不合格。生物指示劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基渾濁，表示有菌生長(zhǎng)；陰性對(duì)照組澄清透明，視為無(wú)菌生長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基進(jìn)氣口端、中間端保持澄清，視為完全滅菌，尾端渾濁，視為未完全滅菌。

B品牌消毒機(jī)消毒完成后，各點(diǎn)化學(xué)指示卡由紅褐色完全變?yōu)辄S色，視為合格。生物指示劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基渾濁，表示有菌生長(zhǎng)；陰性對(duì)照組澄清透明，視為無(wú)菌生長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基保持澄清透明，視為完全滅菌。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中過(guò)濾器風(fēng)阻壓力為250 Pa，允許通過(guò)的最大風(fēng)量為4 080 m3/h。因汽化過(guò)氧化氫穿透性差，ABSL-4實(shí)驗(yàn)室的雙層過(guò)濾器難以滲透，故采取風(fēng)機(jī)速率至少為200 m3/h的過(guò)氧化氫消毒機(jī)。國(guó)內(nèi)常用的過(guò)氧化氫消毒機(jī)均針對(duì)實(shí)驗(yàn)室消毒，沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)HEPA設(shè)計(jì)消毒機(jī)。根據(jù)實(shí)際應(yīng)用狀況，筆者針對(duì)本文討論的消毒機(jī)給出以下建議：

（1）A品牌消毒機(jī)的風(fēng)機(jī)速率小，不能完全滲透第2層過(guò)濾器，其尾端（出氣口端）不符合消毒效果要求。建議廠家改進(jìn)消毒機(jī)內(nèi)風(fēng)機(jī)，提高風(fēng)量。

（2）B品牌消毒機(jī)具備風(fēng)機(jī)風(fēng)量大和智能控制2個(gè)優(yōu)點(diǎn)，其主動(dòng)循環(huán)功能使汽化過(guò)氧化氫穿透HEPA速率加快。相比A品牌消毒過(guò)程，B品牌消毒機(jī)用時(shí)短，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明消毒效果達(dá)到要求。但在連接HEPA方面，仍存在泄漏的風(fēng)險(xiǎn)。建議B品牌消毒機(jī)改進(jìn)回流和氣密性設(shè)計(jì)，達(dá)到安全、高效滅菌。

（3）對(duì)于使用方：建議在購(gòu)買(mǎi)前注意消毒機(jī)的各項(xiàng)參數(shù)，尤其是風(fēng)速、風(fēng)量等關(guān)鍵參數(shù)；另外，應(yīng)選擇“層層過(guò)濾”的方式對(duì)HEPA進(jìn)行消毒過(guò)濾。將2層HEPA中間的檢樣口作為消毒口，從根本上解決消毒不徹底、雙層難穿越的問(wèn)題，但需注意進(jìn)、出口流量與消毒機(jī)的要求相同。

4 結(jié)語(yǔ)

生物安全是國(guó)家安全的重要組成部分，而高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室又是生物安全領(lǐng)域的國(guó)之重器。HEPA作為生物安全實(shí)驗(yàn)室必不可少的關(guān)鍵防護(hù)設(shè)備，對(duì)其進(jìn)行消毒十分關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)外的過(guò)氧化氫消毒機(jī)對(duì)雙層HEPA的消毒效果有限，但根據(jù)其自身特點(diǎn)以及技術(shù)的推陳出新，國(guó)內(nèi)必將出現(xiàn)更多適用的消毒設(shè)備。本文通過(guò)分析雙層HEPA采用過(guò)氧化氫消毒方式的消毒效果，提出了3點(diǎn)建議。同時(shí)，希望同行業(yè)工作者給出更專(zhuān)業(yè)的消毒方式方法，提高我國(guó)生物安全的防護(hù)水平。