單 敏 ， 安 娜 ， 劉宏鋒 ， 張偉偉 ， 劉 欣

(1.聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心 ， 北京 海淀 100089 ； 2.美聯(lián)眾合動(dòng)物醫(yī)院轉(zhuǎn)診中心 ， 北京 朝陽(yáng) 100012)

利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)屬于錐體蟲科利什曼蟲屬的原蟲，該原蟲會(huì)引起人及多種動(dòng)物利什曼病，是一種重要的人獸共患病。利什曼原蟲主要感染對(duì)象包括蹄兔目、嚙齒目、犬科和人類。該病發(fā)展緩慢，具有一定的潛伏期，臨床表現(xiàn)為不規(guī)則發(fā)熱，肝脾腫大，漸進(jìn)性貧血和血漿球蛋白升高等。利什曼原蟲的生活史包括前鞭毛體和無(wú)鞭毛體2個(gè)時(shí)期。前者寄生于節(jié)肢動(dòng)物(白蛉或羅蛉)的消化道內(nèi)，后者寄生于哺乳動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)白蛉叮咬傳播。目前全世界有88個(gè)國(guó)家報(bào)告過(guò)利什曼原蟲癥的病例，威脅健康人數(shù)達(dá)3.5億[1]。我國(guó)關(guān)于利什曼原蟲感染的病例報(bào)道較少，本文就2例犬利什曼原蟲感染病例介紹如下。

1 病例情況

1.1 病例1 雄性泰迪犬，2歲。注射狂犬疫苗后，出現(xiàn)脫毛，厭食,身體消瘦，發(fā)熱等臨床癥狀。右側(cè)肩胛部大片脫毛，被覆大量白色結(jié)痂，四肢及眼周存在少量結(jié)痂，皮膚與黏膜結(jié)合處輕微破潰結(jié)痂。

1.2 病例2 雌性雜種犬，1歲。最初表現(xiàn)為打噴嚏，2周后出現(xiàn)鼻出血，發(fā)熱癥狀，后又出現(xiàn)便血癥狀。體格檢查發(fā)現(xiàn)下頜淋巴結(jié)及腘淋巴結(jié)腫大。

2 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

2.1 血常規(guī)及血液生化檢測(cè) 病例1及病例2均顯示動(dòng)物存在貧血(見(jiàn)表1)，血液生化結(jié)果顯示，兩例患犬球蛋白水平顯著升高(見(jiàn)表2)。

2.3 顯微鏡觀察 對(duì)病例1體表結(jié)節(jié)及病例2淋巴結(jié)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，均可見(jiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)存在大量的利什曼原蟲無(wú)鞭毛體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)中插彩版圖1及圖2)。

圖1 病例1體表結(jié)節(jié)細(xì)胞學(xué)檢查(Diff-Quik染色，1 000×)

圖2 病例2淋巴結(jié)細(xì)胞學(xué)檢查(Diff-Quik染色，1 000×)

表1 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

表2 生化檢測(cè)結(jié)果

2.4 PCR檢測(cè)和分型

2.4.1 目的基因PCR擴(kuò)增 將病例1的皮膚刮取物、淋巴組織和病例2的血液樣本送至聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心進(jìn)行PCR鑒定。聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心對(duì)臨床收集的病例1和病例2樣本分別提取基因組DNA，隨后用利什曼原蟲的18S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，電泳條帶大小為602 bp(見(jiàn)圖3和圖4)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，證實(shí)為利什曼原蟲。

圖3 病例1 18S rDNA基因PCR鑒定
M： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ； 1： 病例1 ； N： 陰性對(duì)照

2.4.2 序列測(cè)定和分型 為進(jìn)一步對(duì)利什曼原蟲分型，將用18S rDNA引物擴(kuò)增的目的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果與杜氏、嬰兒和恰氏利什曼原蟲的同源性為100%，再次表明該病例為利什曼原蟲病。為進(jìn)一步確診利什曼原蟲的分型，用LGITSF2/LGITSR2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[2]，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，獲得約400 bp的特異性片段(見(jiàn)圖5和圖6)，與預(yù)期擴(kuò)增的片段大小(372～450 bp)相符。之后將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，用于區(qū)分杜氏和嬰兒/恰氏利什曼原蟲兩種亞型(見(jiàn)圖7)。經(jīng)比對(duì)表明病例1和病例2均為嬰兒/恰氏利什曼原蟲感染。

圖4 病例2 18S rDNA基因PCR鑒定
M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ； 2：病例2 ； N：陰性對(duì)照

圖5 病例1 LGITS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
M： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ； 1： 病例1 ； N： 陰性對(duì)照

圖6 病例2 LGITS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) ； 2：病例2 ； N：陰性對(duì)照

圖7 基因片段序列1801269064-A：病例1LGITS基因片段序列 ；1803089981-B：病例2LGITS基因片段序列

3 治療

根據(jù)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確，診該兩犬患有利什曼原蟲病后，采用別嘌呤醇(10～20 mg/kg·bw，每天2次，口服，連用6-18個(gè)月)和米替福新(2 mg/kg·bw，每天1次，與食物同時(shí)口服，連用4周)進(jìn)行治療。

4 治療結(jié)果

經(jīng)過(guò)治療后，病例1和病例2臨床癥狀均有緩解，血常規(guī)檢測(cè)各項(xiàng)結(jié)果均在正常參考范圍內(nèi)，血液生化檢測(cè)結(jié)果顯示，球蛋白水平高于正常水平(表3)。

表3 生化檢測(cè)結(jié)果

5 討論

在我國(guó)人群中主要流行杜氏利什曼原蟲，杜氏利什曼原蟲是黑熱病的病原。犬源型的病原為嬰兒利什曼原蟲，且犬的感染率高，人的感染大都來(lái)自病犬，散在發(fā)生[3]。1990年WHO利什曼病專家委員會(huì)將杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲和恰氏利什曼原蟲三者視為杜氏利什曼原蟲復(fù)合體[4]?，F(xiàn)許多學(xué)者將嬰兒利什曼原蟲和恰氏利什曼原蟲視為同一型[3]。

利什曼原蟲的感染機(jī)制復(fù)雜，所致臨床癥狀存在較大差異[5]。犬感染利什曼原蟲潛伏期可長(zhǎng)達(dá)6周-7年，早期逐漸發(fā)病，癥狀不典型，主要以發(fā)熱、脾臟、淋巴結(jié)病變?yōu)橹鱗6]。蟲體侵入機(jī)體后主要引起多臟器感染，并引起消瘦、食欲不振、沉郁、咳嗽等臨床癥狀，皮膚病變特征為過(guò)度角質(zhì)化、增厚、皮屑以及皮膚、黏膜的潰瘍。

經(jīng)檢測(cè)病例1和病例2出現(xiàn)血細(xì)胞減少和血漿球蛋白升高等癥狀，初步符合利什曼原蟲病臨床癥狀。針對(duì)利什曼原蟲的檢測(cè)最早主要是基于細(xì)胞學(xué)檢查，觀察到原蟲就即可確診[3]。經(jīng)顯微鏡觀察，在病例1和病例2的巨噬細(xì)胞內(nèi)均存在大量的利什曼原蟲無(wú)鞭毛體。但當(dāng)宿主體內(nèi)蟲體量較低時(shí)細(xì)胞學(xué)檢查可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

在利什曼原蟲檢測(cè)方法中，PCR技術(shù)具有較高的靈敏性和特異性[7]。已有研究表明，PCR法可對(duì)血液中的利什曼原蟲特異DNA片段進(jìn)行高效擴(kuò)增檢測(cè)，具有病原學(xué)診斷的意義，且能通過(guò)片段序列比對(duì)分析致病蟲種[8]。本病例中，用LGITSF2/LGITSR2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，2只患犬的測(cè)序結(jié)果與嬰兒利什曼原蟲病的同源性為100%。

犬利什曼原蟲病的主要感染源來(lái)自于病犬，無(wú)論是感染利什曼原蟲的犬還是人類，較長(zhǎng)的潛伏期及不明顯的臨床癥狀，都使臨床上出現(xiàn)較多的誤診的情況。PCR法檢測(cè)方法具有較高的敏感性和特異性，能高效地發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀犬或感染犬，有助于較好的指導(dǎo)犬利什曼原蟲病的預(yù)防控制工作。