貽貝蛋白酶解體系穩(wěn)定性影響因素及其機制

毛鳳嬌 易俊潔 喬美玲 王震宇 秦 磊 杜 明

（1 大連工業(yè)大學食品學院 國家海洋食品工程技術研究中心 遼寧大連116034 2 昆明理工大學農業(yè)與食品學院 云南昆明650500）

貽貝在我國北方俗稱“海紅”，其干制品名為“淡菜”，自然分布于黃海、潮海沿岸，人工南移后，東海和南海也可養(yǎng)殖、生產，年產量達85 萬t[1-2]，其中大連的產量居全國之首[3-4]。貽貝含有大量人體必需的無機微量元素，且含有多種對人體有益的營養(yǎng)物質，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有40%～50%的蛋白質，20%～30%的碳水化合物，10%～12%的脂肪[5-6]，被人們譽為“海中雞蛋”。

貽貝作為一種重要的海洋經濟貝類，含有多種不飽和脂肪酸[7]、礦物質元素[8]、生物活性肽[9-10]等多種功能性物質，具有很高的營養(yǎng)價值[11]。隨著對貽貝加工利用研究的深入，開發(fā)具有生理活性的貽貝深加工產品，具有巨大的發(fā)展前景[12]。目前，活性多肽的氨基酸組成及序列直接相關[13]。采用酶解法將貽貝蛋白分子中功能性肽段釋放出來，進而將其開發(fā)成不同功能活性的多肽產品，相關研究引起廣泛關注[14]。然而，由于HMP 體系中同時存在蛋白質、多肽、氨基酸等多種物質，體系組成較為復雜，該體系較為不穩(wěn)定，這嚴重限制了其在飲料工業(yè)的應用[15]。本研究從上述問題出發(fā)，重點研究蛋白濃度和pH 值等因素對貽貝蛋白酶解體系顆粒分布及穩(wěn)定性的影響，確定有利于體系穩(wěn)定的最適條件，同時研究粒度分布與宏觀穩(wěn)定性的關系，旨在為貽貝蛋白的深度開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與主要儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 新鮮貽貝，產地大連，選擇個體大小均勻的為宜。

1.1.2 試劑 中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、福林酚試劑、考馬斯亮藍等生化試劑，索萊寶生物科技有限公司（北京）；其它化學試劑均為分析純，國藥試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器設備

Zetasize 3000 HSA 激光粒度分析儀，英國MALVERA 儀器公司；4000 Q-TRAP 液相色譜質譜聯(lián)用儀，德國Thermo 公司；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR 公司；UDK129 凱氏定氮儀，意大利VELP；AE-8135 垂直電泳，日本ATTO公司；CR22離心機，Hitachi/日立；pH 計Sartorius，科學儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 貽貝酶解液的制備

將新鮮貽貝用水沖洗干凈，然后用去離子水潤洗，去殼、去足絲后，將貽貝肉剪碎；采用6 000 r/min 勻漿5 min。將貽貝勻漿液樣品按料液比1 ∶3 的比例加水混合，分別用1 mol/L HCl 和0.5 mol/L NaOH 調節(jié)溶液pH 值，選擇5 000 U/g 的中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶[16]分別在pH 7.5（40 ℃）、pH 2（37 ℃）、pH 8.5（45 ℃）條件下酶解120 min；滴加0.1 mol/L HCl 或0.2 mol/L NaOH維持酶解過程中溶液pH 值的恒定，待酶解完成后沸水浴滅酶10 min，酶解液8 000 r/min 離心15 min，即得貽貝多肽酶解液冷藏備用。

2.2 貽貝酶解液水解度的測定

在上述貽貝蛋白酶解過程中，滴加0.1 mol/L HCl 或0.2 mol/L NaOH 維持酶解過程中溶液pH值恒定[17]。水解度根據滴加的酸（堿）量按照如下公式進行計算：

式中，B——堿液的體積（mL）；Nb——堿液濃度 （mol/L）；Mp——底物中蛋白質的總量（g）；htot——底物中蛋白質肽鍵總數（mmol/g）；a——氨基酸的解離度。

2.3 蛋白質沉淀率測定

將各種不同條件下制備的酶解液樣品置于真空冷凍干燥機中凍干36 h，將凍干粉用凱氏定氮法測其蛋白含量后按一定比例溶解在去離子水中，得到3%，2%，1%，0.5%不同質量分數的HMP，將其在4 ℃下放置7 d 后離心取上清液，測定蛋白沉淀率。

通過凱氏定氮法分析并計算樣品中蛋白質含量，具體如下：

式中，C——標準鹽酸溶液的濃度（mol/L），試驗中是0.10015 mol/L；V1——滴定樣品用去的鹽酸體積 （mL）；V2——滴定空白用去的鹽酸體積（mL）；0.014——氮的毫摩爾質量；m——樣品的用量，試驗中是2.0 mg；6.25——蛋白質的轉換系數。

貯存前、后蛋白沉淀率計算公式：

式中，P0——貯存前蛋白含量 （%）；P1——貯存后蛋白含量（%）。

2.4 其它分析與檢測方法

通過液相色譜-質譜聯(lián)用技術進行游離氨基酸含量測定[18]，通過SDS-PAGE 測定蛋白分子質量的分布[19]，通過激光粒度分析儀測定酶解液體系粒度[20]。通過上述幾個指標的綜合分析酶解條件對體系穩(wěn)定性的影響。

2.5 統(tǒng)計分析方法

所有試驗均設計重復3 次，試驗數據采用平均值標準差表示。采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析。

3 結果與分析

3.1 酶種類對穩(wěn)定性的影響

利用上述3 種酶對貽貝進行酶解，結果顯示中性蛋白酶的水解度為6.6%、 胃蛋白酶僅有3%而胰蛋白酶為13.2%（圖1），胰蛋白酶酶解體系游離氨基酸含量為219.18 mg/kg，中性蛋白酶和胃蛋白酶酶解體系游離氨基酸含量僅為186.58，186.81 mg/kg（圖2），高于胃蛋白酶和中性蛋白酶。胰蛋白酶體系的蛋白沉淀率為9.52%，低于其它兩種酶解體系（圖3）。3 種酶解體系的分子質量分布如圖4所示，胰蛋白酶酶解液的分子質量主要分布在40～20 ku 之間，分子質量分布比較集中，與空白對照組相比分子質量明顯降低，略高于胃蛋白酶酶解體系，與中性蛋白酶酶解體系差異不大。

以光強度為權重的平均粒度（Di），體積為權重的平均粒度（Dv）和數均粒度（Dn）來表述不同酶解體系的粒度分布情況。結果如表1所示：以Dn 表征粒度及分布，樣品Ⅰ中有99.9%的粒子為納米級小粒子，粒度分布在30.4 nm 左右，另有0.1%的粒子粒度未檢出，樣品Ⅱ、 Ⅲ顯示均有100%納米級小粒子存在；Di、Dv 表明體系中還有少量的較大粒子的存在，其中Di 對大粒子測定結果顯著。表明用Di 表征粒子的粒度分布具有較高靈敏度。將樣品放置7 d 檢測體系粒度變化，樣品Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ體系粒子的粒度均變大，Dn 顯示樣品Ⅳ出現了5.7%的較大粒度的粒子；Di 表明樣品Ⅳ的最大粒度在636.6 nm 左右，樣品Ⅴ最大粒度在746.3 nm 左右，樣品Ⅳ最大粒度在530.1 nm 左右。圖5更加清晰的表明胰蛋白酶酶解體系較其它兩種酶解體系穩(wěn)定。

圖1 不同HMP 的水解度曲線Fig.1 Degree of hydrolysis of different HMP

圖2 不同HMP 游離氨基酸含量Fig.2 Contents of free amino acids in different HMP

圖3 不同HMP 蛋白質沉淀率Fig.3 Protein sediment rates of different HMP

圖4 不同HMP 蛋白分子質量分布Fig.4 Protein and peptides distribution of different HMP

表1 不同HMP 粒度分布Table1 Particle size distribution of different HMP

圖5 不同HMP 粒度分布Fig.5 Particle size distribution of different HMP

3.2 蛋白濃度對穩(wěn)定性的影響

分別對HMP 蛋白含量為3%，2%，1%，0.5%4 ℃放置7 d 情況下的蛋白沉淀率和粒度分布進行測定。測定結果如圖6所示，從圖中可以看出，隨著蛋白濃度的增加，7 d 后的蛋白沉淀率呈明顯的下降趨勢，含量為0.5%的樣品蛋白沉淀率僅為2.00%（P＜0.05），差異不顯著。表2、圖7列出了樣品貯藏前和貯藏7 d 后HMP 粒度分布情況，貯藏前4 組樣品Dn 均顯示具有單一峰，且含有99.9%的小粒度粒子，Di 顯示樣品Ⅰ、Ⅱ的大粒子粒度分別為456.4，741.4 nm，而樣品Ⅲ、Ⅳ主要以小粒子形式存在。7 d 后，4 個樣品的粒度均出現變大的趨勢，蛋白濃度較高的樣品相對顯著。根據斯托克斯（Stokes）定律[22]，沉降速度與顆粒直徑的平方成正比。蛋白粒子愈大，沉降速度愈快，反之愈慢。HMP 中蛋白粒子間的相互作用力主要是范德華引力和同電荷粒子之間的靜電斥力。范德華引力與靜電斥力之和為蛋白膠體溶液穩(wěn)定性的總位能。在一定濃度下，當分散介質粒子的斥力位能絕對值大于引力位能絕對值時，膠體溶液是穩(wěn)定的。否則，蛋白質粒子彼此接近，發(fā)生絮凝而出現不穩(wěn)定的現象[23]。

圖6 貯存后不同蛋白濃度酶解體系的沉淀率Fig.6 Protein sediment rates of different concentrations after storage of HMP

在HMP 中，蛋白質的含量決定了粒子間范德華引力和靜電斥力大小。蛋白質的含量越高，蛋白質粒子間的相對距離越小，HMP 越容易產生沉淀和凝聚[24]。因此，要保證在蛋白質含量相對較低的條件下才更有利于維持HMP 的穩(wěn)定性，然而考慮到蛋白飲料中蛋白質的含量不得低于1%。因此，將選定1%的HMP 為今后研究其穩(wěn)定性的一項指標。

表2 不同蛋白濃度多肽液粒度分布Table2 Particle size distribution of different concentrations of HMP

（續(xù)表2）

圖7 不同蛋白濃度多肽液粒度分布Fig.7 Particle size distribution of different concentrations of HMP

3.3 pH 值對穩(wěn)定性的影響

不同pH 值條件下HMP 蛋白含量及其變化趨勢如圖8所示，酶解多肽液pH 值為8.0 時蛋白質含量最高（為292.81 μg/mL），隨著pH 值條件的改變，蛋白質含量變化顯著。當pH 值為2.0～3.0時，其蛋白質含量較低不足50 μg/mL，而當pH 值為6.0～8.0 時，蛋白質含量呈明顯的上升趨勢，pH值為5 時，上清液中的蛋白含量發(fā)生明顯的變化，表明HMP 中蛋白質的等電點在5 左右。從圖8中蛋白含量變化趨勢可以明顯看出，pH 值對HMP蛋白質的穩(wěn)定性影響很大，在酸性條件下，HMP中的蛋白質含量保留均較小，由于每一種蛋白質都有最適合的pH 等電點，在這個范圍內，蛋白質的靜電力最小，不利于蛋白質的保留[25]。

從上述結果中可以看出在堿性條件下更有利于HMP 中蛋白質的穩(wěn)定。因此，將堿性條件不同pH 值下的樣品放置7 d 后離心，測其上清液的蛋白質含量，并和0 d 相比計算其蛋白沉淀率，進一步驗證pH 值對蛋白質穩(wěn)定性的影響。

從圖9中可以看出HMP 放置7 d 后，隨pH值的升高蛋白質含量仍然呈上升趨勢，pH 條件的改變，蛋白質相對含量變化顯著，pH 值為8.0 時，蛋白質相對含量達到100%，pH 值對HMP 蛋白穩(wěn)定性影響較大，蛋白質在溶液中存在兩性電離的現象，當pH 值在等電點以下時，蛋白質呈正離子狀態(tài)；當pH 值高于蛋白質的等電點時，蛋白質分子則成負離子狀態(tài)。在等電點附近，蛋白質分子的靜電荷為零，蛋白質分子呈電中性，水化作用弱，在溶液中的溶解性相對較差，粒子間相互作用力減弱，分子間相互碰撞蓄積而產生沉淀，導致樣品中蛋白質穩(wěn)定性降低[26]。蛋白質分子表面的極性基團與水分子之間的吸引力使蛋白質分子在水溶液中高度水化，在其分子周圍結成一層水化膜，形成穩(wěn)定的蛋白質膠體溶液，溶液的pH 值對蛋白質的水化作用有顯著影響。在等電點附近，水化作用最弱，蛋白質的溶解度也最小。溶液的pH 值離蛋白質的等電點越遠，則水化作用越強，溶液越穩(wěn)定，蛋白越不易產生沉淀[27]。

為了進一步說明pH 值對蛋白質穩(wěn)定性的影響，該研究采用ZETASIZER 3000 HSA 粒度分析測定儀[20]對不同pH 值條件下HMP 混合分散體系進行粒度分布的測定，結果如表3所示。

圖8 不同pH 值多肽液蛋白含量Fig.8 Protein content of different pH value polypeptide liquid

圖9 貯存后不同pH 值多肽液蛋白沉淀率Fig.9 The protein precipitation rate in different pH value polypeptide liquid after storage

表3 不同pH 值多肽液粒度分布Table3 Particle size distribution of different pH value peptides

（續(xù)表3）

圖10 不同pH 值多肽液粒度分布Fig.10 Particle size distribution of different pH value peptides

除試樣Ⅰ外Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的粒度分布Di，Dv，Dn，3 種粒度分布均為單峰，呈規(guī)則的正態(tài)分布，其平均粒度值（491.8，349.8，256.0 nm）呈遞減趨勢，表明體系的粒度和pH 值呈負相關。將不同pH 值的樣品放置7 d 的粒度分布，如表3、圖10 所示，樣品ⅣDv 表明大小粒度分布比例分別為33.2%，31.0%，35.8%分布均勻，Dn 表明大粒度的粒子比例為4.6%，較其它幾組樣品體系相對穩(wěn)定，小粒度粒子所占比例大。

4 結論

通過考察不同種類酶、pH 值、 蛋白質含量等對HMP 中蛋白質穩(wěn)定性的影響，發(fā)現體系環(huán)境不同對蛋白質穩(wěn)定性的影響程度差異很大。其中胰蛋白酶酶解液的水解度為13.2%，游離氨基酸總量高達291.18 mg/kg，蛋白提取率為92.98%，沉淀率僅為9.52%，蛋白分子質量的分布范圍較集中在小分子區(qū)域，粒度均小于其它兩種酶解體系。蛋白粒子間的相互作用力強弱與蛋白質濃度直接相關，因此不同濃度的蛋白質體系表現出不同的體系穩(wěn)定性。蛋白質濃度越低，體系中蛋白離子間的范德華引力和靜電斥力越大，蛋白質越不容易聚集產生沉淀。HMP 蛋白的穩(wěn)定性隨環(huán)境的堿性增大而增強，因此HMP 可以通過調節(jié)pH 值來提高其穩(wěn)定性。綜上所述，不同的酶、不同pH 值、不同蛋白質濃度是通過改變體系中蛋白質的存在狀態(tài)而造成其穩(wěn)定性的改變。