魷魚內臟多糖的分離純化、理化性質及抗氧化活性研究

楊嘉梁 陳小娥，3 方旭波* 勵建榮 馬永鈞 勞敏軍

（1 浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院 浙江舟山316022 2 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧錦州121013 3 舟山市海大科學技術研究院 浙江舟山316041 4 浙江興業(yè)集團有限公司 浙江舟山316101）

魷魚屬軟體動物門頭足綱，又稱槍烏賊或柔魚，主要分布于大西洋、印度洋和太平洋等海域，是世界上三大未充分開發(fā)利用，且具有很大開發(fā)潛力的海洋生物資源之一[1-2]。秘魯魷魚（Dosidicus gigas）俗稱美洲大赤魷，是迄今為止發(fā)現(xiàn)個體最大、資源最豐富的魷魚種類之一，物產豐富，價格低廉，近年來，成為我國遠洋魷釣的重要捕撈對象[3]。

秘魯魷魚的內臟約占總體重的15%～20%，是魷魚制品加工過程中的主要副產物，據(jù)市場調研發(fā)現(xiàn)魷魚內臟大都作為魚粉加工企業(yè)生產魷魚膏的原料。然而，魷魚內臟中含有豐富的蛋白質、糖類、氨基酸、?；撬?、微量元素以及多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質[4]。國外對魷魚內臟活性物質的研究報道，主要為活性酶類的提取，如從魷魚肝胰腺中提取氨肽酶[5]，從魷魚內臟中提取消化酶[6]等；國內也有關于魷魚纏卵腺黏蛋白[7]、魷魚內臟糖蛋白[8]提取工藝的研究報道等。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)一些海洋動物內臟多糖具有良好的抗氧化性，如鮑魚性腺多糖[9]、單環(huán)刺螠內臟多糖[10]等。對頭足類海洋動物內臟多糖的研究中，有學者研究報道了烏賊墨多糖，如吳金龍等[11]發(fā)現(xiàn)烏賊墨多糖對冷藏小魷魚有較好的防腐抗菌作用，羅萍等[12]研究了烏賊墨多糖的體外抗氧化活性，結果表明：在體外環(huán)境中，烏賊墨多糖抗氧化力明顯。然而，國內外鮮有對頭足類海洋動物產量最大的魷魚進行內臟多糖類活性物質結構或活性的報道，僅對魷魚內臟中占比較小部分的魷魚墨進行了研究，發(fā)現(xiàn)魷魚墨多糖能夠改善小鼠腸道氧化應激損傷[13]，經過硫酸化修飾后的魷魚墨多糖具有抑制腫瘤轉移的作用[14]。而資源量大的魷魚內臟中的多糖是否有類似于魷魚墨、烏賊墨多糖一樣的抗氧化活性，亟需進一步研究。為了探究魷魚內臟多糖的抗氧化活性，充分挖掘魷魚內臟資源潛力，提高其附加值，本文對魷魚內臟中的多糖物質進行提取與抗氧化活性研究。

Liu 等[15]在文中指出多糖的抗氧化活性與其結構特征密切相關，例如：硫酸化程度、分子質量、主要的單糖種類、糖苷鍵的鏈接類型等。本文以秘魯魷魚內臟為原料，提取其中的多糖類物質，并對魷魚內臟多糖進行分離純化，研究其理化性質、結構組成以及抗氧化活性，探索魷魚內臟多糖結構、體外抗氧化活性及兩者之間的構效關系，為進一步開發(fā)天然抗氧化劑，提高魷魚內臟附加值，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

新鮮秘魯魷魚內臟，浙江富丹旅游食品有限公司，-20 ℃冰箱保存。

DEAE Sepharose Fast Flow，瑞典Amersham Biosciences 公司；Sephadex G-100、葡聚糖系列標準物（色譜純），瑞典Pharmacia 公司；MD3544 普通型透析袋，上海源葉生物科技有限公司；標準牛血清蛋白、 考馬斯亮藍G-250、DPPH 試劑，美國Sigma 公司；單糖標準品 （色譜純）、D-半乳糖醛酸、抗壞血酸（VC）等其它化學試劑，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器及設備

DS-1 高速組織搗碎機，無錫沃信儀器有限公司；UV-5900 型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；LXJ-IIB 型低速大容量多管離心機，上海安亭科學儀器廠；LGJ-10 冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；AKTA Purifier 100 快速蛋白純化系統(tǒng)，瑞典Pharmacia Biotech公司；Waters 2695 高效液相色譜儀 （配Waters 2695 示差折光檢測器），美國Waters 公司；Nicolet 6700 紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 取魷魚內臟200 g 自然解凍，去除魷魚墨囊及性腺，用高速組織搗碎機勻漿。

1.3.2 魷魚內臟粗多糖的提取 將上述魷魚內臟勻漿液，在100 ℃條件下，按料液比1∶20 浸提3 h。提取液5 000 r/min 離心10 min，取離心后的上清液50 ℃旋蒸濃縮至適量體積，然后加入4 倍體積的無水乙醇于4 ℃冰箱放置過夜。5 000 r/min離心取醇沉物，依次用無水乙醇、丙酮及無水乙醚洗滌，Sevag 法[16]除去蛋白雜質后裝入透析袋（截留分子質量3.5 ku）透析48 h，冷凍干燥得到魷魚內臟粗多糖（Squid viscera polysaccharides，SVP）。

1.3.3 魷魚內臟粗多糖（SVP）的分離和純化 取SVP 加去離子水配制成50 mg/mL 的溶液，0.45 μm 濾膜過濾，在AKTA Purifier 100 快速蛋白純化系統(tǒng)上，采用平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析柱（2.6 cm×30 cm），依次用去離子水和0～1.0 mol/L 的NaCl 溶液梯度洗脫。上樣量2 mL，流速1.5 mL/min，每管收集8 mL。以苯酚-硫酸法[17]隔管檢測，繪制洗脫曲線。合并吸收峰處洗脫液，經濃縮、 透析后分別上樣于Sephadex G-100 凝膠柱（1.6 cm×80 cm），去離子水洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集6 mL，用苯酚-硫酸法逐管監(jiān)測，繪制洗脫曲線。合并峰值處洗脫液，凍干后分別得到SVP-1 和SVP-2。

1.3.4 純度及分子質量分布 SVP-1 和SVP-2的純度及分子質量的測定采用HPGPC 法[17]，Waters 高效液相色譜系統(tǒng)，色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTM Linear （7.8 mm×30 cm）；柱溫35℃；流動相為0.1 mol/L Na2SO4溶液；流速0.5 mL/min；樣品溶液質量濃度為0.5 mg/mL；進樣量20 μL。采用比旋光度法[18]鑒定兩者極性均一程度，分別用質量分數(shù)60%和80%的乙醇沉淀SVP-1和SVP-2 的半飽和溶液，將所得沉淀配制成10 mg/mL 溶液，于20 ℃下測定比旋度。

1.3.5 熱穩(wěn)定性分析 差示掃描量熱法參照佘志剛等[19]的方法，設置參數(shù)為：升溫速率10 ℃/min，起始溫度40 ℃，終止溫度300 ℃，氮氣為保護氣，分析SVP-1 和SVP-2 的熱穩(wěn)定性。

1.3.6 基本組成分析 分別測定SVP、SVP-1 和SVP-2 的多糖含量：苯酚-硫酸法[17]；總蛋白含量：考馬斯亮藍（Bradford）法[7]；糖醛酸含量：硫酸-咔唑法[20]；硫酸基含量：氯化鋇-明膠比色法[21]，每組數(shù)據(jù)至少重復測定3 次。

1.3.7 單糖組成分析 采用離子色譜法測定SVP-1 和SVP-2 單糖組成。樣品經三氟乙酸（TFA），于121 ℃下水解2 h，去除TFA 后定容，對水解溶液稀釋后進行單糖測定，色譜柱及色譜條件參照于青等[22]的方法。

1.3.8 紅外光譜分析 SVP、SVP-1 和SVP-2 的紅外光譜分析參照潘瑩等[23]的方法：將1 mg 干燥樣品分別與100 mg KBr 粉末混勻，經研磨后壓片，在4000～400 cm-1波長范圍內進行紅外光譜掃描。

1.3.9 魷魚內臟多糖抗氧化活性分析

1.3.9.1 DPPH 自由基清除率的測定 按 照 文獻[23]的方法，測定不同質量濃度SVP-1 和SVP-2 溶液的DPPH 自由基清除率，以VC 為陽性對照。

1.3.9.2 羥自由基（·OH）清除率的測定 以Fenton 反應[24]檢測不同質量濃度SVP-1 和SVP-2 溶液清除·OH 的能力，以VC 為陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 8.0 軟件繪圖，試驗結果用平均值±標準差表示（n=3），并利用SPSS 19.0 進行差異性檢驗和回歸分析。

2 結果與分析

2.1 魷魚內臟粗多糖（SVP）的提取

魷魚內臟經水提醇沉法提取、Sevag 法脫蛋白、真空冷凍干燥得到淡黃色纖維狀粗多糖SVP。初步測定其抗氧化活性，當SVP 質量濃度為10 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率為（38.55±0.17）%，說明魷魚內臟粗多糖具有一定的抗氧化活性，為進一步研究其抗氧化活性，故對SVP 進行分離純化、理化性質、結構組成等研究。

2.2 SVP 的分離和純化

SVP 經過DEAE Sepharose Fast Flow 離子交換層析后，洗脫曲線如圖1所示。經去離子水和0～1.0 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，得到3 個洗脫峰，峰1 和峰3 的多糖含量遠高于峰2，因此分別將峰1 和峰3 的洗脫液濃縮、 透析后經Sephadex G-100 凝膠柱純化，得到圖2所示洗脫曲線。由峰1 得到單一對稱峰，將洗脫液凍干后得到SVP-1；由峰3 得到2 個分離的峰，取多糖含量較高組分的洗脫液凍干后得到SVP-2。

圖1 SVP 的DEAE Sepharose Fast Flow 洗脫曲線Fig.1 The elution curve of SVP on DEAE Sepharose Fast Flow column

圖2 SVP-1 和SVP-2 的Sephadex G-100 洗脫曲線Fig.2 The elution curve of SVP-1 and SVP-2 on Sephadex G-100 column

2.3 SVP-1 和SVP-2 的分子質量及純度

SVP-1 和SVP-2 經HPGPC 法分析得到圖3所示的狹窄單一對稱峰，表明兩者分子質量集中且純度良好。經計算可得SVP-1 和SVP-2 的分子質量分別為12.39 ku 和22.83 ku，SVP-2 的分子質量稍大于SVP-1，兩者分子質量與鮑魚性腺多糖[9]和單環(huán)刺螠內臟多糖[10]均較接近，同為小分子多糖。方旭波等[18]報道，當不同濃度醇沉多糖的比旋度一致時，其極性均一，純度較好。在本試驗中由不同質量分數(shù) （60%和80%） 的乙醇分別沉淀SVP-1 和SVP-2 溶液，所得多糖沉淀的比旋度基本一致，室溫20 ℃時，SVP-1 比旋度均在+8.5°左右，SVP-2 比旋度均在+23.4°左右。綜上表明，SVP-1 和SVP-2 無論是分子質量還是極性都比較均一，純度較好。

圖3 SVP-1 和SVP-2 高效凝膠滲透色譜圖Fig.3 The HPGPC chromatograms of SVP-1 and SVP-2

2.4 熱穩(wěn)定性分析

差示熱量掃描儀檢測出的曲線圖在最大遷移點處顯示樣品的熱變性溫度。由SVP-1 和SVP-2樣品的熱變性曲線圖（圖4）發(fā)現(xiàn)：在溫度40～300℃內，氮氣流保護下，SVP-1 僅有一個吸熱峰在154.4 ℃左右，表明SVP-1 由固體變成熔融狀態(tài)，在154.4 ℃以前沒有狀態(tài)變化，性質穩(wěn)定。236.5℃之后有一個放熱峰，此時SVP-1 可能發(fā)生熱分解。同理，SVP-2 只有一個吸熱峰在116.5 ℃左右，表明SVP-2 發(fā)生熔融，而在300 ℃以內未出現(xiàn)熱分解引起的放熱峰，說明SVP-2 的熱穩(wěn)定性更好。由此可得，SVP-1 和SVP-2 在100 ℃內均無狀態(tài)變化，熱穩(wěn)定性較好，有利于后續(xù)開發(fā)多糖產品，常溫貯藏，保證產品質量。

圖4 SVP-1 和SVP-2 的差示掃描量熱法分析曲線Fig.4 Differential scanning calorimetry curves of SVP-1 and SVP-2

2.5 多糖基本成分分析

對分離純化前、 后魷魚內臟多糖的基本成分進行分析，從表中數(shù)據(jù)可知：魷魚內臟多糖SVP 經過分離純化后，其蛋白含量大大降低，SVP-1 和SVP-2 為純化后的多糖，苯酚-硫酸法測得其多糖含量分別為83.39%、70.36%，均含少量蛋白，表明SVP-1 和SVP-2 結構中可能存在結合蛋白。組分SVP-1 不含糖醛酸和硫酸基，是一種中性多糖；組分SVP-2 糖醛酸和硫酸基含量分別為9.57%和7.06%，是一種含硫酸基的酸性多糖。

表1 魷魚內臟多糖的基本成分Table1 Chemical composition of polysaccharides from squid viscera

2.6 SVP-1 和SVP-2 的單糖組成分析

以9 種單糖標準品的離子色譜圖 （圖5）作為參考，SVP-1 和SVP-2 水解液中單糖的離子色譜如圖6所示，對比發(fā)現(xiàn)：SVP-1 的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，物質的量比依次為11.6 ∶30.4 ∶22.4 ∶11.4 ∶13.9；SVP-2 的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，物質的量比依次為9.5 ∶23.7 ∶35.7 ∶16.2 ∶8.3。由此可知SVP-1 和SVP-2 均為雜多糖，兩者單糖組成種類基本一致，比例存在一定差異，其中阿拉伯糖、半乳糖和木糖比例差異較大。SVP-2 與Ye 等[25]從海參中純化得到的硫酸多糖AMP-2 的單糖組成基本一致，均以半乳糖為主要單糖組成。

圖5 單糖標準品的離子色譜圖Fig.5 Ion chromatogram of the standard solution of monosacchrides

圖6 SVP-1 和SVP-2 水解液中單糖的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatograms of monosacchrides in hydrolysate of SVP-1 and SVP-2

2.7 紅外光譜分析

對SVP，SVP-1 和SVP-2 分別做紅外光譜分析，由譜圖可知三者均具有多糖類物質的特征吸收峰（3 420，2 940，1 620，1 400，1 100 cm-1）[26]。其中3420 cm-1附近的強吸收峰為糖類O-H 的伸縮振動峰；2 940 cm-1附近的吸收峰是C-H 的伸縮振動峰；1 640 cm-1和1 400 cm-1附近的吸收峰分別為C=O 伸縮振動峰及C-H 變形振動峰。1 100 cm-1附近的吸收峰表明三者可能存在β-吡喃型糖環(huán)結構[27]。此外，SVP-2 中還含有1 238 cm-1及833 cm-1的吸收峰，前者源于S-O 的不對稱伸縮振動，后者為C-O-S 對稱伸縮振動峰[28]，再次證實SVP-2 中含有硫酸基團，是酸性多糖。

圖7 SVP，SVP-1 和SVP-2 的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of crude SVP，SVP-1 and SVP-2

2.8 抗氧化活性測定結果

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 對SVP-1 和SVP-2 做抗氧化活性檢測，以VC 為陽性對照，檢測DPPH 自由基清除能力發(fā)現(xiàn)：不同質量濃度的SVP-1 和SVP-2 對DPPH 自由基清除率差異顯著（P＜0.05），表明兩種樣品的DPPH 自由基清除率隨質量濃度的增大而顯著增加，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應；當質量濃度增大到一定值時，DPPH 自由基清除能力可與陽性對照VC 相當。回歸分析得SVP-1 和SVP-2 對DPPH 自由基清除率的IC50分別為3.93 mg/mL 和2.05 mg/mL。含硫酸基的SVP-2 清除DPPH 自由基能力略強于SVP-1，與Melo 等[29]報道的海參多糖結果一致，DPPH 自由基清除率為含硫酸基的多糖高于不含硫酸基的多糖，再次驗證發(fā)現(xiàn)多糖硫酸化程度與抗氧化活性（DPPH 自由基清除率）有關。

2.8.2 ·OH 清除能力 為了多方面檢測魷魚內臟多糖的抗氧化活性，本文對魷魚內臟多糖進行·OH 清除能力的檢測。由圖9可得：SVP-1 和SVP-2 對·OH 清除率也隨質量濃度的增大而顯著增加，具有一定的劑量依賴效應。回歸分析得SVP-1 和SVP-2 對·OH 清除率的IC50分別為3.38 mg/mL 和3.05 mg/mL，兩者能力相當。據(jù)Yuan 等[30]報道，·OH 清除活性與多糖中氨基酸基團的數(shù)量相關，SVP-1 雖無硫酸基團，但蛋白含量略高于SVP-2，因而含有較多氨基酸基團，提高了SVP-1 清除·OH 的能力。

圖8 VC、SVP-1 和SVP-2 對DPPH 自由基的清除效果Fig.8 DPPH radical scavenging capacity of VC，SVP-1 and SVP-2

圖9 VC、SVP-1 和SVP-2 對·OH 的清除效果Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of VC，SVP-1 and SVP-2

通過對兩種純化多糖DPPH 自由基和·OH 清除能力的研究，可得出SVP-1 和SVP-2 的DPPH自由基清除率的IC50分別為3.93 mg/mL 和2.05 mg/mL；·OH 清除率的IC50分別為3.38 mg/mL 和3.05 mg/mL，具有較高的抗氧化活性，可能是由于體外氧化自由基（DPPH 自由基和·OH 等）奪取多糖中的自由氫后失去氧化性，從而使魷魚內臟多糖具有較高的抗氧化活性。與烏賊墨多糖[12]的體外抗氧化活性相比，魷魚內臟多糖的體外抗氧化活性更高；魷魚墨多糖[13]可改善小鼠腸道氧化應激損傷，而魷魚內臟多糖具有體外自由基清除能力，表明兩者均具有相類似的抗氧化活性。

3 結論

本文以秘魯魷魚內臟為原料，經水提醇沉法提取得到SVP，SVP 經過DEAE Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 柱分離純化得到2 個組分SVP-1 和SVP-2。由HPGPC 得 到SVP-1 和SVP-2 的分子質量分別為12.39 ku 和22.83 ku，20 ℃時比旋度分別為+8.5°和+23.4°，說明兩種純多糖分子質量集中、極性均一且純度較好；SVP-1和SVP-2 在100 ℃以內熱穩(wěn)定性較好，有利于后續(xù)開發(fā)產品，常溫貯藏；SVP-1 的多糖含量較高為83.39%，總蛋白含量為6.09%，不含糖醛酸和硫酸基，是一種中性多糖；SVP-2 多糖含量為70.36%，總蛋白含量為4.85%，糖醛酸含量為9.57%，硫酸基含量為7.06%，是一種含硫酸基的酸性多糖；紅外光譜分析表明兩者均具有多糖的特征吸收峰，且含有β-吡喃糖環(huán)結構，而SVP-2 還具有明顯的硫酸基吸收峰；離子色譜法測得SVP-1 的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，物質的量比為11.6 ∶30.4 ∶22.4 ∶11.4 ∶13.9；SVP-2 的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，物質的量比依次為：9.5∶23.7∶35.7∶16.2∶8.3，組成兩者的單糖種類基本一致，比例存在一定的差異；SVP-1 和SVP-2 對DPPH 自由基的IC50分別為3.93 mg/mL 和2.05 mg/mL，對·OH 的IC50分別為3.38 mg/mL 和3.05 mg/mL，表明兩種多糖均具有一定的抗氧化活性。

綜上對SVP-1 和SVP-2 理化性質、結構組成及抗氧化活性的研究，可得出SVP-1 為中性多糖，SVP-2 為酸性多糖，且均與魷魚墨、烏賊墨一樣具有較高的抗氧化活性，可為高值化利用魷魚內臟，開發(fā)魷魚內臟多糖類產品提供理論參考。