荔枝多糖的超聲-微波提取工藝優(yōu)化及其免疫調(diào)節(jié)作用

劉 洋 黃 菲 李巍巍 唐小俊 張瑞芬 張名位*

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 武漢 430070 2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 廣州510610）

荔枝（Litchi chinensis Sonn）是無患子科（Sapindacceae）荔枝屬的常綠喬木，為我國華南地區(qū)的特色水果。其果肉味甜、多汁，富含多糖、酚類、膳食纖維等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高藥用價值[1]。據(jù)中醫(yī)記載，荔枝果肉能夠治療或改善血氣不足、失眠健忘、貧血、脾虛等癥狀[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，荔枝多糖是荔枝果肉的主要活性成分之一，具有抗氧化[3-6]，免疫調(diào)節(jié)[7-8]，降血糖[9-10]等作用。

基于荔枝免疫調(diào)節(jié)活性的機制研究及滿足其精深加工的需要，多糖提取分離技術(shù)的改進(jìn)至關(guān)重要。傳統(tǒng)的植物多糖提取方法主要是熱水浸提法[11-12]，雖然操作簡單，使用儀器少，但是存在耗時長，提取率低等不足之處。隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的不斷發(fā)展，植物多糖的提取也獲得了較大突破。目前關(guān)于荔枝果肉多糖的提取仍多以熱水浸提法為主。除此之外，董周永等[13]研究了家庭式微波爐對荔枝果肉多糖提取率的影響；陳衛(wèi)云[14]和彭剛[15]分別探究了超聲微波酶解協(xié)同技術(shù)對荔枝果肉多糖提取率及其清除自由基的影響。然而，針對超聲-微波提取的荔枝多糖的體內(nèi)免疫活性研究尚無報道。由于超聲波的空化效應(yīng)以及微波特有的熱效應(yīng)和機械效應(yīng)，一方面，能夠加速細(xì)胞壁組織破裂，促進(jìn)多糖的溶出；另一方面，可能改變多糖的結(jié)構(gòu)，從而引起其活性發(fā)生變化[16-17]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波提取荔枝果肉多糖的提取工藝，并通過動物實驗?zāi)Ｐ驮u價其體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

荔枝品種為“黑葉”，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供，2016年7月采摘于其實驗園地。KM 小鼠和YAC-1 細(xì)胞由中山醫(yī)學(xué)院實驗動物研究中心提供。

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、HBSS 緩沖溶液，美國Gibco 公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、刀豆球蛋白A（ConA）、青鏈霉素，美國Sigma 公司；印度墨汁，德國Chroma-Gesellschaft 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

CW-2000 型超聲－微波協(xié)同萃取儀，上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械；ZL-1 真空冷凍干燥機，上海醫(yī)療器械高等?？茖W(xué)校實驗廠；FA-1104 電子天平，上海天平儀器廠；TDL-40B 離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；HEPA CLASS 100 CO2培養(yǎng)箱、MK3 353 酶聯(lián)免疫檢測儀，Thermo Labsystems；超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡，重慶光電儀器公司；UV-9100 紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 實驗動物及前處理

實驗小鼠分成2 批飼養(yǎng)，第一批用于血清溶血素水平的測定，第二批用于小鼠免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖和NK 細(xì)胞殺傷活性的測定。每批小鼠分為4 組：空白對照組（Control），多糖低劑量組（LP-50）、多糖中劑量組（LP-100）和多糖高劑量組（LP-200），每組10 只。低、中、高劑量多糖組分別每天灌胃50，100，200 mg/kg 的荔枝多糖（LP）溶液，空白對照組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)給藥28 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 荔枝多糖提取 荔枝干和荔枝果粉的制備參照黃菲等[18]的方法。

荔枝多糖提?。阂欢康恼麴s水溶解稱取的荔枝果肉粉末（質(zhì)量為M），將其置于超聲－微波協(xié)同萃取儀中反應(yīng)一段時間后，趁熱用紗布過濾，離心（4 800 g/15 min），取上清置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/4，用95%乙醇醇沉（乙醇終濃度為80%），4 ℃冰箱靜置24 h，離心 （4 800 g/15 min），將沉淀用80%乙醇、無水乙醇依次洗滌、抽濾，重復(fù)上述抽濾操作1 次，獲得沉淀，真空冷凍干燥即得荔枝果肉多糖。

1.3.2 荔枝多糖提取率計算 將獲得的多糖加水復(fù)溶至一定體積（V），采用苯酚-硫酸法測定其總糖含量C[19]。多糖得率按照如下公式計算：

多糖得率（%）＝C×V/M×100

式中，C——多糖質(zhì)量濃度 （g/L）；V——多糖體積（L）；M——荔枝果肉粉質(zhì)量（g）。

1.3.3 荔枝多糖提取響應(yīng)面分析因素水平的選取依據(jù)中心組合原則，分別選取pH 值、功率、提取時間和水/料比4 個參數(shù)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用4 因素5 水平的響應(yīng)面分析法，以多糖得率為響應(yīng)值（Y），以pH 值（X1）、功率（X2）、時 間（X3）、水/料比（X4）為自變量，具體設(shè)計見表1，試驗方案及結(jié)果見表2。試驗分為析因試驗和中心點試驗兩部分，其中1-24 試驗編號為析因試驗，試驗編號25-31 為中心點試驗。31 個點分別為析因點和零點，析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5 次以上，用來評估試驗誤差。

表1 響應(yīng)面分析的因素與水平Table1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.4 血清溶血素測定 采用實驗室前期建立的方法[20]，具體如下：實驗結(jié)束前一周，每只小鼠腹腔注射5%（體積分?jǐn)?shù)）的雞紅細(xì)胞（CRBC）懸液0.2 mL 進(jìn)行免疫。7 d 后摘眼球取血，并收集于1.5 mL離心管中，2 500 r/min 離心20 min 分離血清。血清經(jīng)生理鹽水稀釋150 倍后，取1 mL 加入2 mL 離心管中，再加入2%CRBC 懸液0.5 mL 和10%補體（豚鼠血清）0.5 mL，混勻。另以生理鹽水代替血清作為空白調(diào)零。在37 ℃恒溫箱中溶血反應(yīng)30 min后，0 ℃冰水浴中止反應(yīng)，1 800 r/min 離心5 min，并于540 nm 波長處測定上清液OD 值。同樣，0.25 mL 的2%CRBC 懸液與1.75 mL 去離子水混合孵育測定CRBC 半數(shù)溶血（HC50）時的OD 值。實驗小鼠血清中溶血素水平以HC50表征，即：HC50=樣品OD/血清稀釋倍數(shù)×CRBC 半數(shù)溶血OD。

1.3.5 免疫器官指數(shù)測定 實驗小鼠頸椎脫臼處死后，將其完全浸沒在75%乙醇中1～2 min，無菌條件下分離脾臟和胸腺，稱重。按下式計算免疫臟器指數(shù)：

胸腺指數(shù)（%）=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100

脾臟指數(shù)（%）=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100

1.3.6 NK 細(xì)胞殺傷活性測定 脾細(xì)胞懸液的制備參照實驗室前期的試驗方法[21]。將獲得的脾臟在無菌的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中剪碎，經(jīng)滅菌的4 層醫(yī)用紗布過濾吸取脾細(xì)胞懸液。以1 000 r/min離心5 min 沉淀脾細(xì)胞，棄去上清液，加入1 mL無菌水重懸細(xì)胞沉淀以裂解紅細(xì)胞，30 s 后立即加入1 mL 的1.7%NaCl 溶液平衡細(xì)胞滲透壓。細(xì)胞懸液于1 000 r/min 下離心5 min，棄去上清液后用適量的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸，得單個脾細(xì)胞懸液。臺盼蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)大于95%，以培養(yǎng)液調(diào)整脾淋巴細(xì)胞濃度為1×107cells/mL。以處于對數(shù)生長期的YAC-1 細(xì)胞作為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105細(xì)胞/mL。以50 μL/孔向96 孔培養(yǎng)板中加入脾淋巴細(xì)胞懸液，作為效應(yīng)細(xì)胞。每只小鼠來源的脾淋巴細(xì)胞均設(shè)6 個復(fù)孔，其中3 孔各加入50 μL 靶細(xì)胞作為試驗孔，另外3 孔加入50 μL 培養(yǎng)液作為效應(yīng)細(xì)胞對照孔。此外，設(shè)3 個靶細(xì)胞對照孔（50 μL 靶細(xì)胞和50 μL 培養(yǎng)液），100 μL 培養(yǎng)液孔用于調(diào)零。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中孵育4 h 后，每孔加入20 μL 的5 mg/mL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加入100 μL 酸性異丙醇，放置12 h。培養(yǎng)板輕微振蕩混勻后，采用酶標(biāo)儀于570 nm 下測定各孔OD 值，NK 細(xì)胞殺傷活性（%）=[靶細(xì)胞對照孔OD-（實驗孔OD-效應(yīng)細(xì)胞對照孔OD）]/100×靶細(xì)胞對照孔OD。

1.3.7 脾淋巴細(xì)胞增殖活性測定 將上述制備的脾細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為5×106/mL，以90 μL/孔加入96 孔培養(yǎng)板中，每只小鼠來源細(xì)胞均設(shè)6 個復(fù)孔，其中3 孔各加入10 μL 的50 μg/mL ConA 作為刺激孔，另外3 孔各加入10 μL 培養(yǎng)液作為對照孔。另設(shè)100 μL 的培養(yǎng)液孔用于調(diào)零。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中培養(yǎng)68 h，每孔加入20 μL 的MTT（5 mg/mL）。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加入100 μL 酸性異丙醇，放置12 h。培養(yǎng)板輕微振蕩混勻后，采用酶標(biāo)儀于570 nm 波長下測定各孔OD 值[21]。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)處理 響應(yīng)面設(shè)計采用SAS8.1 分析軟件分析，動物實驗采用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件單因素方差分析進(jìn)行組間差異的比較，組間的兩兩比較采用S-N-K 檢驗 （the Student-Newman-Keuls test），顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)均以±s表示。圖表中采用不同小寫字母表示0.05 水平顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝多糖的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面結(jié)果與分析 響應(yīng)面設(shè)計各因素水平的荔枝多糖得率見表2。通過SAS8.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

對上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出，回歸模型P＜0.0001，說明回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項P=0.16449＞0.05，不顯著，說明該模型是合適的。模型復(fù)相關(guān)系系數(shù)的平方R2為0.9802，說明該方程擬合度較高，故該模型可以用于本工藝的實際推測。對各項F 值檢驗可知，各參數(shù)的二次項P＜0.01，為極顯著影響，且微波功率和水/料比交互項P＜0.01，為極顯著影響（表3）。各因子的貢獻(xiàn)率為：X3＞X4＞X1＞X2，即提取時間＞水/料比＞pH 值＞微波功率。

2.1.2 優(yōu)化與驗證 依據(jù)所得模型，進(jìn)一步確定各因素的最佳條件，求得優(yōu)化的提取條件：pH 值為8.2，微波功率559 W，提取時間10.8 min，水/料比為22.7∶1，在此條件下多糖提取產(chǎn)率為24.33%。經(jīng)3 次驗證試驗取平均值得實際荔枝多糖提取率

為24.02%，與理論值相比，相對誤差為1.3%。由此說明，此法優(yōu)化得到的荔枝果肉多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確度高，對實際操作具有指導(dǎo)意義。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table2 Response surface analysis and results

表3 試驗結(jié)果方差分析表Table3 Variance analysis of test results

2.2 荔枝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用

2.2.1 血清溶血素 通過檢測血清溶血素對細(xì)胞性抗原的響應(yīng)表達(dá)，評價荔枝多糖LP 對小鼠補體系統(tǒng)的影響，結(jié)果如圖1所示。與正常對照組相比，低劑量的荔枝多糖對小鼠的血清溶血素?zé)o顯著影響（P＞0.05），而高劑量的荔枝多糖能顯著提升血清溶血素水平（P＜0.05），具有促進(jìn)小鼠補體免疫功能。

2.2.2 免疫器官臟器指數(shù) 小鼠的器官指數(shù)在一定程度上反應(yīng)其免疫功能。荔枝多糖在50～200 mg/kg 范圍內(nèi)對小鼠脾臟指數(shù)無顯著影響，而100 mg/kg 的荔枝多糖能顯著增加小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.05）。

2.2.3 NK 細(xì)胞殺傷活性 為探究荔枝多糖對小鼠非特異性免疫狀態(tài)的影響，本研究測定了各組小鼠中NK 細(xì)胞對YAC-1 細(xì)胞的殺傷活性。由圖2可見，相比于對照組，各個劑量的荔枝多糖均能顯著促進(jìn)小鼠的NK 細(xì)胞殺傷活性 （P＜0.05），在100 mg/kg 的劑量下，NK 細(xì)胞的殺傷活性最大達(dá)到53.07%，是空白對照組的1.84 倍。

2.2.4 脾淋巴細(xì)胞增殖活性 脾淋巴細(xì)胞增殖對于激活細(xì)胞免疫和體液免疫活性都有重要影響。因此，試驗分析荔枝多糖對淋巴細(xì)胞的影響，結(jié)果如圖3所示。與空白組相比，不同劑量的荔枝多糖均能顯著提高小鼠的血清溶血素水平 （P＜0.05），且100 mg/kg 荔枝多糖的促進(jìn)效果最顯著。

3 討論

圖1 荔枝多糖LP 對小鼠血清溶血素水平的影響Fig.1 Effect of LP on serum hemolysin production

表4 荔枝多糖對小鼠脾臟及胸腺指數(shù)的影響Table4 Effect of LCP on spleen and thymus index in mice

圖2 荔枝多糖LP 對NK 細(xì)胞殺傷活性的影響Fig.2 Effect of LP on NK cell cytotoxicity

圖3 荔枝多糖LP 對淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of LP on splenic lymphocyte proliferation

目前對于荔枝果肉多糖的提取分離方法，主要以常見的熱水浸提為主。由于品種及操作方法不同，提取率也有所差異。多糖主要存在于植物細(xì)胞壁中[22]，是一類極性強的大分子化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易溶于水，水是最常用的提取溶劑，加熱有利于加速多糖的溶出，故熱水浸提法是最早也是使用最廣泛的提取荔枝多糖的方法。唐小俊等和李雪華等[11-12]采用熱水浸提法，有效提取出荔枝多糖，得率較低，分別為4.36%[23]和3.30%[24]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)一些物理、生物方法可以加快細(xì)胞壁的破裂，因而在熱水浸提的基礎(chǔ)上出現(xiàn)微波、超聲及酶解協(xié)同提取。董周永等[13]采用微波提取，得率為6.17%，其多糖含量為60.1%。吳雅靜等[25]采用超聲波輔助提取，提取率可達(dá)18.94%。酶解通過生物手段，依據(jù)細(xì)胞壁的構(gòu)成，在相關(guān)酶的作用下，水解破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，釋放多糖。陳衛(wèi)云等[26]以微波酶解協(xié)同法提取荔枝多糖，提取率高達(dá)23.31%。本研究利用超聲-微波萃取儀優(yōu)化荔枝果肉多糖的提取工藝，所得荔枝果肉多糖得率約為24%，是熱水提取法的5～6 倍，比單獨的家庭微波爐或者超聲波法的提取率明顯提高，與微波酶解協(xié)同得率相當(dāng)。

前期課題組研究發(fā)現(xiàn)荔枝果肉多糖具有顯著的體外免疫活性調(diào)節(jié)作用，能夠增加NK 細(xì)胞殺傷活性，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖以及加強巨噬細(xì)胞的吞噬作用[21]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究了其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，攝食荔枝多糖能夠提高小鼠的血清溶血素水平，增加胸腺器官指數(shù)，促進(jìn)NK 細(xì)胞殺傷活性以及刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，從而得出，荔枝多糖具有顯著的體內(nèi)免疫活性調(diào)節(jié)作用。

有研究報道，隨著灌胃劑量的改變，植物多糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用呈雙向調(diào)節(jié)現(xiàn)象，即在某一濃度劑量范圍內(nèi)植物多糖能夠促進(jìn)免疫活性作用增強，增加或減少劑量，活性明顯降低[27]。本試驗研究結(jié)果與此報道相似，中劑量組（100 mg/kg）的荔枝多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性明顯優(yōu)于低劑量組（50 mg/kg）和高劑量組（200 mg/kg），由此可見，荔枝多糖也具有上述雙向免疫調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

1） 采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化荔枝果肉多糖的微波輔助提取工藝參數(shù)：pH 值為8.2，微波功率559 W，提取時間10.8 min，水/料比22.7∶1，在該條件下的多糖提取產(chǎn)率為24.02%。

2） 一定劑量的荔枝多糖可提高小鼠的血清溶血素水平、 胸腺器官指數(shù)、NK 細(xì)胞殺傷活性以及脾淋巴細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。